rhBMP2m在高浓度条件下的复性 - 游戏竞技

作者：王馥丽,陈苏民,陈南春,赵玮钦

【摘要】目的：优化高浓度的人骨形成蛋白2成熟肽（rhBMP2m）的复性条件. 方法：将工程菌株进行高密度发酵、温度诱导表达，裂菌收集包涵体后经离子交换色谱分离纯化. 纯化后的蛋白在不同的温度、复性液pH, 氧化交换系统浓度、盐浓度等条件下进行透析复性. 透析复性后进行非还原的SDSPAGE, 检测rhBMP2m活性形式二聚体的含量，同时找出相对较优的复性方法对复性产物进行0.22 μm微孔滤膜除菌并计算其损失率. 结果：经透析复性后rhBMP2m完全可溶，而且其活性形式二聚体的含量达到30%左右，即复性后二聚体的rhBMP2m可以达到每升发酵液800 mg，并且经微孔滤膜除菌后rhBMP2m活性形式二聚体的含量基本没有损失，同时蛋白定量也表明过滤除菌后蛋白损失不超过10%. 结论：高pH有利于rhBMP2m的复性，除变性剂尿素时采用低pH可以保持高浓度rhBMP2m复性后仍保持可溶. 蛋白质的浓度、pH和温度对蛋白复性的结果影响很大，但盐浓度、氧化交换系统的浓度和透析外液体积对蛋白复性影响不是很大.
【关键词】重组人骨形成蛋白2成熟肽;蛋白质/分离和提纯；蛋白质复性
　　0引言
　　骨形成蛋白(bone morphogenetic protEin, BMP) 是转化生长因子β (transforming growth factorbeta, TGFβ) 超家族的成员, 是广泛分布于动物骨组织的酸性蛋白质, 在修复骨质缺损和促进骨折愈合等方面发挥重要作用［1］，其诱导成骨的活性很强，是骨骼系统形成和正常发育所必不可少的因子［2］. 目前，重组人骨形成蛋白2成熟肽(recombinant human bone morphogenetic protein2 mature peptide，rhBMP2m) 已经被商业化生产并应用在多种临床研究中，包括治疗骨质缺损、颌面修复等. 但由于利用哺乳动物细胞制备rhBMP2m，其表达水平很低，纯化过程复杂，使得产品价格高昂，制约着其推广应用［3］. 虽然从大肠杆菌制备BMP产量高、成本低，但由于BMP活性形式是由含有3对二硫键的成熟肽肽链再以二硫键连接而成的二聚体［4］，而且BMP含有两个伸展的非极性片段［5］，具有很强的疏水性容易沉淀，使BMP复性的难度很大，目前所报道的复性方法［6］，在线复性［7］等用于rhBMP者都还有待改进. 本研究探索和优化rhBMP2m的复性条件，试图提高复性的二聚体产量，以解决rhBMP2m疏水难溶、不能过滤除菌等难题.
　　1材料和方法
　　1.1材料菌种DH5α/pDH2rhBMP2m由本教研室构建并保存; BioFloⅣ型15 L全自动发酵罐（美国NBS公司）；SPSepharose FF, QSepharose FF（Pharmacia公司）；透析膜(截留分子质量10 000)（华美公司）；低温高速离心机（湘西仪器仪表厂）；超声细胞粉碎仪JY983（宁波新芝科仪研究所）；SDSPAGE垂直平板电泳系统（BIORED公司）；溶菌酶（Invitrogen）去氧胆酸钠（上海伯奥生物科技有限公司）；TritonX100（FARCO CHEMICAL）；DNAase I, SDS（SIGMA公司）；丙烯酰胺、NN亚甲基双丙烯酰胺、醋酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、尿素、β巯基乙醇等均为分析纯国产试剂, （天津化学试剂六厂和沈阳化学试剂厂）；BCA蛋白定量试剂为本实验室配制；Low protein marker，标准蛋白（上海生物化学研究所）.
　　1.2方法
　　1.2.1DH5α/pDH2rhBMP2m高密度发酵采用恒溶氧高密度发酵方法［8］. 取-70℃保存的DH5α/pDH2rhBMP2m工程菌株甘油菌种，划LB琼脂平板，含100 μg/mL氨苄青霉素，32℃培养20 h. 挑单菌落接入6 mL LB培养基中，30℃摇床培养16 h. 转入300 mL LB，30℃摇床培养10 h. 转入15 L发酵罐，计算机自动控制搅拌、通气溶氧，30℃继续培养16 h. 发酵罐内42℃诱导表达4 h，结束发酵，6000 r/min 离心收菌.
　　1.2.2裂菌、包涵体纯化用裂解缓冲液(100 g/L蔗糖,10 mmol/L pH 8.0 TrisHCl，1 mmol/L EDTA)悬浮发酵所得到的菌体，置冰浴中，按3 mg/g湿菌加入溶菌酶裂菌，16 000 g离心后收得包涵体. 按每克湿沉淀加入3 mL包涵体洗涤液(5 g/L TritonX100，10 mmol/L pH 8.0 TrisHCl，1 mmol/L EDTA)悬浮包涵体，超声处理，1360 W，9 s，间歇6 s，20个循环. 16 000 g离心收集包涵体,反复4次.
　　1.2.3离子交换层析纯化rhBMP2m① SPSepharose FF阳离子柱层析分离：洗涤后的包涵体溶解于pH 6.5的SPbuffer(8 mol/L尿素，20 mmol/L pH 6.5磷酸钠缓冲液，0.014 mol/L β巯基乙醇)中，充分溶解后上SPSepharose FF阳离子柱，用适合浓度的NaCl溶液洗脱，收集蛋白峰，透析除去尿素β巯基乙醇，离心收集沉淀. ② QSepharose FF阴离子柱层析纯化：将SPSepharose FF柱层析纯化的蛋白质沉淀溶解于pH 9.0的Q buffer(8 mol/L尿素，20 mmol/L pH 9.0 Tris，0.014 mol/L β巯基乙醇)中，充分溶解后上QSepharose FF阳离子柱，用适合浓度NaCl溶液洗脱，收集蛋白峰，透析除去尿素和β巯基乙醇，离心收集沉淀.
　　1.2.4蛋白复性纯化后的rhBMP2m经变性液(8 mol/L尿素，20 mmol/L pH 6.5磷酸钠缓冲液，0.014 mol/L β巯基乙醇)溶解，装入透析袋内，对不同的透析外液进行透析复性. 各种复性液的组成（表1）. 复性后，逐步透析除去尿素和β巯基乙醇. 最后收集复性蛋白液，复性的蛋白液可通过0.22 μm微孔滤膜除菌，或进一步浓缩和冰冻干燥.
　　1.2.5蛋白定量用NaOH 0.1 mol/L将BSA标准品(1 μg/mL)稀释成梯度浓度：1000，800，600，400，200，0 μg/mL，同样将蛋白样品倍比稀释至适当浓度(0～1000 μg/mL). 样品、梯度标准品各50 μL，分别加入200 μL工作液(工作液A和B以50∶1的比例均匀混合)，混匀后37℃水浴30 min，以ELISA reader测A562 nm(或A570 nm)吸光度值. 作图画出标准曲线，并决定未知样本的浓度.
　　1.2.6过滤除菌筛选出合适的复性条件，然后将复性后的rhBMP2m经0.22 μm微孔滤膜除菌，对通过微孔滤膜前后的液体进行蛋白定量，并计算其损失率.
　　2结果
　　2.1rhBMP2m的发酵及包涵体纯化发酵罐中DH5α/pDH2rhBMP2m培养16 h和诱导表达4 h后，测发酵液A600 nm=60.5. 发酵液中rhBMP2m占细菌总蛋白量的20%. 蛋白定量后测算发酵液中rhBMP2m为3.2 g/L. 经洗涤的包涵体中rhBMP2m纯度为70%. 包涵体经SPSepharose FF柱层析，目的蛋白出现在0.28 mol/L及0.78 mol/L的氯化钠溶液洗脱峰内. 蛋白回收率为60%，rhBMP2m纯度为85%. 经SPSepharose FF柱层析后的蛋白经QSepharose FF柱层析纯化，目的蛋白位于0.06 mol/L的氯化钠洗脱峰内. 透析除去尿素，离心收集蛋白，蛋白回收率为85%，rhBMP2m的纯度达到95%. 经阳离子和阴离子柱纯化后，目的蛋白的回收率为30%.
　　2.2rhBMP2m的透析复性经不同复性缓冲液透析复性后进行非还原SDSPAGE，然后进行灰度扫描，得到结果（表1）.
　　表1不同复性液的组成及复性后蛋白各组分的比率（略）
　　复性液12透析复性后的产物为可溶性，复性产物中二聚体含量占总蛋白量的30%左右. 同时得到非还原的SDSPAGE结果（图1）
　　M: marker; 1: 复性前; 2: 复性后.
　　图1复性液12的复性产物非还原SDS-PAGE分析（略）
　　2.3过滤除菌复性液12透析复性的rhBMP2m经0.22 μm微孔滤膜除菌，所得到非还原SDSPAGE结果（图2）. 灰度扫描提示二聚体的含量基本没有变化，同时蛋白定量也提示复性后rhBMP2m经0.22 μm微孔滤膜除菌后蛋白损失不超过10%.