作者：伍徐娴，何志旭，沈祥春，周中军
【摘要】 目的： 应用增强型绿色荧光蛋白-C1（enhanced green fluorescent protEin，pEGFPC1）标记骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells, MMSCs），以期为MMSCs的体内移植提供示踪方法。方法: 在体外分离培养大鼠MMSCs，流式细胞仪检测细胞表型，以脂质体介导法转染质粒增强型绿色荧光蛋白基因，荧光显微镜观察基因表达。结果: pEGFPC1在基因转染24 h后开始表达，48～72 h达高峰，12～14 d后有较多的表达。结论: 由脂质体介导的质粒pEGFPC1可较为安全、有效地转染MMSCs,是一种较为理想的干细胞示踪方法。
【关键词】 骨髓间充质干细胞； 增强型绿色荧光蛋白； 基因转染
［Abstract］Objective: To develop an appropriate tracing method for transplanted marrow mesenchymal stem cells (MMSCs) in vivo. Methods: MMSCs of rats were isolated from bone marrow and purified by adherent culture in vitro, and the cell membrane's marks were detected with flow cytometer.Cultured cells were transfected with expressing plamid of pEGFPC1 mediated by lipofectamine,and transient expression was subsequently observed with fluorescent microscopy. Results: The expression of pEGFPC1 was initially found in 24h after the transfection，reached peak in 48～72 h，and remained strong express for 12～14 more days. Conclusion: Lipofectamine mediated transfection can make pEGFPC1 expressed in MMSCs safely and effectively, which shows that it is an ideal method for stem cell tracking.
［Key words］ marrow mesenchymal stem cells; enhanced green fluorescent protein; gene transfec- tion
骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells,MMSCs）成为近年来干细胞研究的热点，其不仅本身可发挥 治疗 作用，同时也可作为外源基因的载体和表达场所[1]，是基因治疗理想的种子细胞[2]。2007年3月～2008年3月通过对大鼠MMSCs体外增殖培养，应用增强型绿色荧光蛋白C1（pEGFPC1）基因表达的质粒转染MMSCs并筛选培养，旨在建立一个较好的基因标记条件，为MMSCs应用于后续基因治疗的可行性奠定基础，为MMSCs的生物学行为提供新的示踪方法。
1 材料与方法
1.1 动物、试剂和仪器
清洁级近交系SD大鼠（贵阳医学院动物实验中心提供）6只，雄性，体重(110±10)g，健康。质粒pEGFPC1由香港大学周中军教授惠赠，菌株E·ColiDH5α由贵阳医学院分子生物学实验室保存并提供，LDMEM购自GIBCO公司，胎牛血清购自杭州四季青公司，离心柱型质粒小提中量试剂盒购自TIANGEN公司，Hind Ⅲ限制性内切酶购自TakaRa公司，脂质体LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司，G-418购自Solarbio公司，荧光显微镜购自Olympus公司。
1.2 大鼠MMSCs的体外分离、纯化、增殖培养及鉴定
取雄性SD大鼠颈椎脱臼法处死，分离股骨及胫骨，收集骨髓腔内细胞，接种于含10％胎牛血清的L-DMEM培养瓶中，37 ℃、饱和湿度、5％CO2培养箱中培养。第3天后半量换液，以后每3 d更换新鲜完全培养液，待细胞接近90％铺满瓶底时，倾去培养液，用0.25％胰蛋白酶常温下消化并传代，用新鲜完全培养基重悬细胞，按照1∶2接种于培养瓶中继续增殖培养。每日定时于倒置相差显微镜下观察，记录细胞形态的变化和增殖情况；取传代培养至第5代的MMSCs制成单细胞悬液，应用流式细胞仪进行细胞膜表面分子CD29、CD34、CD45及CD71的水平检测分析。
1.3 质粒的扩增、提取及鉴定
取大肠杆菌DH5α用氯化钙法制备感受态细菌，将质粒pEGFPC1转化感受态细菌，37 ℃培养24 h，挑取单菌落接种到含卡那霉素（100 mg/L）的LB 液体培养基中，37 ℃震荡（220 r/min）培养过夜，取菌液1.0 ml，按照离心柱型质粒小提中量试剂盒说明书用碱裂解法提取质粒DNA。紫外分光光度计测定质粒DNA 浓度，取1 μg质粒DNA用Hind Ⅲ酶切，1%琼脂糖电泳鉴定酶切结果。
1.4 质粒pEGFPC1转染大鼠MMSCs
应用阳离子脂质体LipofectamineTM2000介导pEGFPC1转染MMSCs，以400 mg/L的G418进行筛选，荧光显微镜下观察细胞并拍照。为提高转染率，质粒DNA∶LipofectamineTM 2000为2 μg∶5 μl，G418的筛选浓度为400 mg/L，均为经优化后的最佳条件。
1.5 表达pEGFPC1基因的MMSCs的生长特性及细胞活力观察
在荧光显微镜和倒置相差显微镜下观察细胞生长及增殖特性。取转染质粒pEGFPC1后1～3代的传代细胞，制成单细胞悬液，以0.4％台盼蓝作为染色剂，用细胞计数板计数活细胞和死细胞，共计3次，取平均值 计算 ，细胞活力（％）＝（总细胞数－着色细胞数）/总细胞数×100％。
【摘要】 目的： 应用增强型绿色荧光蛋白-C1（enhanced green fluorescent protEin，pEGFPC1）标记骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells, MMSCs），以期为MMSCs的体内移植提供示踪方法。方法: 在体外分离培养大鼠MMSCs，流式细胞仪检测细胞表型，以脂质体介导法转染质粒增强型绿色荧光蛋白基因，荧光显微镜观察基因表达。结果: pEGFPC1在基因转染24 h后开始表达，48～72 h达高峰，12～14 d后有较多的表达。结论: 由脂质体介导的质粒pEGFPC1可较为安全、有效地转染MMSCs,是一种较为理想的干细胞示踪方法。
【关键词】 骨髓间充质干细胞； 增强型绿色荧光蛋白； 基因转染
［Abstract］Objective: To develop an appropriate tracing method for transplanted marrow mesenchymal stem cells (MMSCs) in vivo. Methods: MMSCs of rats were isolated from bone marrow and purified by adherent culture in vitro, and the cell membrane's marks were detected with flow cytometer.Cultured cells were transfected with expressing plamid of pEGFPC1 mediated by lipofectamine,and transient expression was subsequently observed with fluorescent microscopy. Results: The expression of pEGFPC1 was initially found in 24h after the transfection，reached peak in 48～72 h，and remained strong express for 12～14 more days. Conclusion: Lipofectamine mediated transfection can make pEGFPC1 expressed in MMSCs safely and effectively, which shows that it is an ideal method for stem cell tracking.
［Key words］ marrow mesenchymal stem cells; enhanced green fluorescent protein; gene transfec- tion
骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells,MMSCs）成为近年来干细胞研究的热点，其不仅本身可发挥 治疗 作用，同时也可作为外源基因的载体和表达场所[1]，是基因治疗理想的种子细胞[2]。2007年3月～2008年3月通过对大鼠MMSCs体外增殖培养，应用增强型绿色荧光蛋白C1（pEGFPC1）基因表达的质粒转染MMSCs并筛选培养，旨在建立一个较好的基因标记条件，为MMSCs应用于后续基因治疗的可行性奠定基础，为MMSCs的生物学行为提供新的示踪方法。
1 材料与方法
1.1 动物、试剂和仪器
清洁级近交系SD大鼠（贵阳医学院动物实验中心提供）6只，雄性，体重(110±10)g，健康。质粒pEGFPC1由香港大学周中军教授惠赠，菌株E·ColiDH5α由贵阳医学院分子生物学实验室保存并提供，LDMEM购自GIBCO公司，胎牛血清购自杭州四季青公司，离心柱型质粒小提中量试剂盒购自TIANGEN公司，Hind Ⅲ限制性内切酶购自TakaRa公司，脂质体LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司，G-418购自Solarbio公司，荧光显微镜购自Olympus公司。
1.2 大鼠MMSCs的体外分离、纯化、增殖培养及鉴定
取雄性SD大鼠颈椎脱臼法处死，分离股骨及胫骨，收集骨髓腔内细胞，接种于含10％胎牛血清的L-DMEM培养瓶中，37 ℃、饱和湿度、5％CO2培养箱中培养。第3天后半量换液，以后每3 d更换新鲜完全培养液，待细胞接近90％铺满瓶底时，倾去培养液，用0.25％胰蛋白酶常温下消化并传代，用新鲜完全培养基重悬细胞，按照1∶2接种于培养瓶中继续增殖培养。每日定时于倒置相差显微镜下观察，记录细胞形态的变化和增殖情况；取传代培养至第5代的MMSCs制成单细胞悬液，应用流式细胞仪进行细胞膜表面分子CD29、CD34、CD45及CD71的水平检测分析。
1.3 质粒的扩增、提取及鉴定
取大肠杆菌DH5α用氯化钙法制备感受态细菌，将质粒pEGFPC1转化感受态细菌，37 ℃培养24 h，挑取单菌落接种到含卡那霉素（100 mg/L）的LB 液体培养基中，37 ℃震荡（220 r/min）培养过夜，取菌液1.0 ml，按照离心柱型质粒小提中量试剂盒说明书用碱裂解法提取质粒DNA。紫外分光光度计测定质粒DNA 浓度，取1 μg质粒DNA用Hind Ⅲ酶切，1%琼脂糖电泳鉴定酶切结果。
1.4 质粒pEGFPC1转染大鼠MMSCs
应用阳离子脂质体LipofectamineTM2000介导pEGFPC1转染MMSCs，以400 mg/L的G418进行筛选，荧光显微镜下观察细胞并拍照。为提高转染率，质粒DNA∶LipofectamineTM 2000为2 μg∶5 μl，G418的筛选浓度为400 mg/L，均为经优化后的最佳条件。
1.5 表达pEGFPC1基因的MMSCs的生长特性及细胞活力观察
在荧光显微镜和倒置相差显微镜下观察细胞生长及增殖特性。取转染质粒pEGFPC1后1～3代的传代细胞，制成单细胞悬液，以0.4％台盼蓝作为染色剂，用细胞计数板计数活细胞和死细胞，共计3次，取平均值 计算 ，细胞活力（％）＝（总细胞数－着色细胞数）/总细胞数×100％。
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