【摘要】 目的测定20种中药饮片中芦丁的含量。方法采用反相高效液相色谱法，以Hypersil GOLD柱（5μm 250mm×4.60mm）为 分析 柱，乙腈∶水 （加磷酸调pH至2.6）（8∶92～30∶70）为流动相，流速：0.8ml/min；检测波长为254nm，柱温30℃。结果芦丁浓度在（0.0095～0.3800）μg范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系。结论该方法简易准确，重现性好，在本色谱条件及样品处理方法下，可以准确测出该20种中药饮片中芦丁的含量。
【关键词】中药；芦丁；高效液相色谱法
【Abstract】 ObjectiveTo establish HPLC method for determination of the content of rutin in 20 kinds of Chinese herbal medicines.MethodsThe HPLC was conducted on a Hypersil GOLD column(5μm，250mm×4.6mm)with acetonitrile-water solution (8∶92～30∶70). The solution was adjusted to pH 2.6 with phosphoric acid and used as mobile phase with the flow rate of 0.8ml/min. The detective wavelength was set to 254 nm and column temperature at 30℃.ResultsThe area under the peak of chromatography is very well correlated with the concentration of rutin in the range of（0.0095～0.3800）μg.ConclusionThis method is simple and accurate. The experimental results are very reproducible. Under the conditions as stated in the method section， the rutin can be separated very well from 20 kinds of Chinese herbal medicines. The concentration of the Rutin， therefore， can be accurately determined.
【Key words】Chinese herbal medicines；rutin；HPLC
芦丁，即芸香苷，是中药饮片中较多见的一种黄酮类成分，有抗炎、降血脂、抗病毒及维生素P样等作用。有关芦丁的HPLC测试方法已有很多报道［1～3］，笔者采用反相高效液相色谱法在50余种常用中药饮片中分离、检测芦丁成分，经在时间轴上（调节色谱条件以使出峰保留时间在10～35min范围内改变）反复与芦丁对照品比较，最后确认其中的20种中药饮片中含有较高的黄酮类物质芦丁。 文献 曾报道该20种药材中的8种含有芦丁［3，4］，但具体含量不详，笔者查阅国内有关文献，未发现在另12种药材中也含有芦丁的最新报道。实验结果可供有关科研和临床工作者 参考 。
1 实验 研究
1.1仪器和试药 Waters高效液相色谱仪，包括510泵，484紫外检测器，680梯度控制器。浙江大学N2000色谱工作站。
芦丁对照品（ 中国 药品生物制品检定所），50种药材样品分3次每次50种分别购自浙江中医学院实验药厂、浙江省中 医院 和浙江中医学院门诊部。经浙江中医学院中药鉴定教研室陈锡林副教授和浙江中医学院实验药厂张云副主任药师鉴定并确认。乙腈为色谱醇，磷酸为分析醇，水为纯净水。
1.2色谱条件 Hypersil GOLD柱（5μm 250mm×4.6mm）；流动相：乙腈∶水（8∶92～30∶70)，加磷酸调pH至2.6；流速：0.8ml/min；检测波长为254nm，柱温为30℃。
1.3对照品溶液配制 精密称取芦丁对照品1.9mg，置 10ml量瓶中，加甲醇至刻度，置超声波中振荡溶解，精密吸取该标准溶液0.01ml、0.05ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml，置1ml定量管中，用淋洗液稀释至刻度备用。
1.4样品处理 取上述三批50种药材的干燥样品各50g，打成粗粉，对应混合，各称取3份，每份2g，置150只100ml大口瓶中，各加50ml甲醇，超声波中振摇15min后浸泡过夜，吸取上清液，经离心，0.45μm滤膜过滤，C18固相萃取器萃取后，用淋洗液稀释5倍待测。
1.5定性分析 调整流动相中乙腈和水的比例，使芦丁标准品的出峰时间控制在10min左右，取上述各待测样品，吸取5μl进样，初步确定该条件下的样品峰型后，加适量芦丁对照品稀释液于该待测样品中（使样品中的对应芦丁峰面积增大1～2倍），再逐次调整流动相比例，使芦丁的出峰时间从10～35min不断延后，观察每次进样出峰时芦丁标准峰与样品中的芦丁特定峰是否完全重叠或重叠峰中有肩峰出现，经反复比较，观察全过程中重叠峰形态完好的，无肩峰或样品中的特定峰出现再分离现象的样品，由此确定其芦丁的成分，见图1。图1是苦丁茶样品及加芦丁标准品后的对照图谱。上述50种被测样品中，符合该定性分析要求的样品有20种。
A.苦丁茶样品(Herba Corydalis bungeanae)
B.苦丁样品+芦丁对照品(Herba Cordalis bungeanae+reference substance of Rutin)
1.芦丁(Rutin)
图1 色谱图
1.6线性范围 精密吸取3种芦丁对照品稀释液各5μl 进样（流动相中的乙腈和水的比例视药材的峰型而定，其他条件不变。对上述含芦丁的20种药材每种都作出其相应的回归方程，这里仅列出3个特殊点上的回归方程Y1、Y2和Y3），记录峰面积，重复3次取平均值。以对照品溶液浓度（X）与其相应峰面积（Y）求得回归方程和相关系数为：
Y1=1.484×106X+1420，r=0.9999。（乙腈∶水=30∶70）
Y2=1.405×106X+1685，r=0.9998。（乙腈∶水=20∶80）
Y3=1.316×106X+1329，r=0.9999。（乙腈∶水=10∶90）
线性范围：0.0095μg～0.3800μg
1.7回收率测试 称取符合定性要求的20种样品粉末各2g 3份，置60只100ml量瓶中，选择3种上述稀释的对照品溶液，分别加入1ml，同样品处理方法处理后进样，记录峰面积，同时以同种相同量对照品稀释液直接进样的峰面积为对照， 计算 回收率。测得20种试液的平均回收率见表1，RSD值见表1中RSD1。
1.8精密度、重复性及稳定性测试 取标准品稀释液中的一种，精密吸取5μl，在各色谱条件下连续进样5次，测得峰面积积分值的RSD见表1中RSD2；取上述20种样品待测液，各精密吸取5μl，连续进样5次，测得峰面积积分值的RSD见表1中RSD3；取上述20种样品待测液，每隔4h各精密吸取5μl进样，连续5次，测得峰面积积分值的RSD见表1中RSD4。
【关键词】中药；芦丁；高效液相色谱法
【Abstract】 ObjectiveTo establish HPLC method for determination of the content of rutin in 20 kinds of Chinese herbal medicines.MethodsThe HPLC was conducted on a Hypersil GOLD column(5μm，250mm×4.6mm)with acetonitrile-water solution (8∶92～30∶70). The solution was adjusted to pH 2.6 with phosphoric acid and used as mobile phase with the flow rate of 0.8ml/min. The detective wavelength was set to 254 nm and column temperature at 30℃.ResultsThe area under the peak of chromatography is very well correlated with the concentration of rutin in the range of（0.0095～0.3800）μg.ConclusionThis method is simple and accurate. The experimental results are very reproducible. Under the conditions as stated in the method section， the rutin can be separated very well from 20 kinds of Chinese herbal medicines. The concentration of the Rutin， therefore， can be accurately determined.
【Key words】Chinese herbal medicines；rutin；HPLC
芦丁，即芸香苷，是中药饮片中较多见的一种黄酮类成分，有抗炎、降血脂、抗病毒及维生素P样等作用。有关芦丁的HPLC测试方法已有很多报道［1～3］，笔者采用反相高效液相色谱法在50余种常用中药饮片中分离、检测芦丁成分，经在时间轴上（调节色谱条件以使出峰保留时间在10～35min范围内改变）反复与芦丁对照品比较，最后确认其中的20种中药饮片中含有较高的黄酮类物质芦丁。 文献 曾报道该20种药材中的8种含有芦丁［3，4］，但具体含量不详，笔者查阅国内有关文献，未发现在另12种药材中也含有芦丁的最新报道。实验结果可供有关科研和临床工作者 参考 。
1 实验 研究
1.1仪器和试药 Waters高效液相色谱仪，包括510泵，484紫外检测器，680梯度控制器。浙江大学N2000色谱工作站。
芦丁对照品（ 中国 药品生物制品检定所），50种药材样品分3次每次50种分别购自浙江中医学院实验药厂、浙江省中 医院 和浙江中医学院门诊部。经浙江中医学院中药鉴定教研室陈锡林副教授和浙江中医学院实验药厂张云副主任药师鉴定并确认。乙腈为色谱醇，磷酸为分析醇，水为纯净水。
1.2色谱条件 Hypersil GOLD柱（5μm 250mm×4.6mm）；流动相：乙腈∶水（8∶92～30∶70)，加磷酸调pH至2.6；流速：0.8ml/min；检测波长为254nm，柱温为30℃。
1.3对照品溶液配制 精密称取芦丁对照品1.9mg，置 10ml量瓶中，加甲醇至刻度，置超声波中振荡溶解，精密吸取该标准溶液0.01ml、0.05ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml，置1ml定量管中，用淋洗液稀释至刻度备用。
1.4样品处理 取上述三批50种药材的干燥样品各50g，打成粗粉，对应混合，各称取3份，每份2g，置150只100ml大口瓶中，各加50ml甲醇，超声波中振摇15min后浸泡过夜，吸取上清液，经离心，0.45μm滤膜过滤，C18固相萃取器萃取后，用淋洗液稀释5倍待测。
1.5定性分析 调整流动相中乙腈和水的比例，使芦丁标准品的出峰时间控制在10min左右，取上述各待测样品，吸取5μl进样，初步确定该条件下的样品峰型后，加适量芦丁对照品稀释液于该待测样品中（使样品中的对应芦丁峰面积增大1～2倍），再逐次调整流动相比例，使芦丁的出峰时间从10～35min不断延后，观察每次进样出峰时芦丁标准峰与样品中的芦丁特定峰是否完全重叠或重叠峰中有肩峰出现，经反复比较，观察全过程中重叠峰形态完好的，无肩峰或样品中的特定峰出现再分离现象的样品，由此确定其芦丁的成分，见图1。图1是苦丁茶样品及加芦丁标准品后的对照图谱。上述50种被测样品中，符合该定性分析要求的样品有20种。
A.苦丁茶样品(Herba Corydalis bungeanae)
B.苦丁样品+芦丁对照品(Herba Cordalis bungeanae+reference substance of Rutin)
1.芦丁(Rutin)
图1 色谱图
1.6线性范围 精密吸取3种芦丁对照品稀释液各5μl 进样（流动相中的乙腈和水的比例视药材的峰型而定，其他条件不变。对上述含芦丁的20种药材每种都作出其相应的回归方程，这里仅列出3个特殊点上的回归方程Y1、Y2和Y3），记录峰面积，重复3次取平均值。以对照品溶液浓度（X）与其相应峰面积（Y）求得回归方程和相关系数为：
Y1=1.484×106X+1420，r=0.9999。（乙腈∶水=30∶70）
Y2=1.405×106X+1685，r=0.9998。（乙腈∶水=20∶80）
Y3=1.316×106X+1329，r=0.9999。（乙腈∶水=10∶90）
线性范围：0.0095μg～0.3800μg
1.7回收率测试 称取符合定性要求的20种样品粉末各2g 3份，置60只100ml量瓶中，选择3种上述稀释的对照品溶液，分别加入1ml，同样品处理方法处理后进样，记录峰面积，同时以同种相同量对照品稀释液直接进样的峰面积为对照， 计算 回收率。测得20种试液的平均回收率见表1，RSD值见表1中RSD1。
1.8精密度、重复性及稳定性测试 取标准品稀释液中的一种，精密吸取5μl，在各色谱条件下连续进样5次，测得峰面积积分值的RSD见表1中RSD2；取上述20种样品待测液，各精密吸取5μl，连续进样5次，测得峰面积积分值的RSD见表1中RSD3；取上述20种样品待测液，每隔4h各精密吸取5μl进样，连续5次，测得峰面积积分值的RSD见表1中RSD4。
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