作者：乔文涛，张静，俞凌雁，马婷婷，袁珂
【摘要】
目的研究提取纯化含羞草中总黄酮的最佳工艺条件。方法以芦丁为对照，含羞草总黄酮得率为考察指标，通过正交实验法优选超声提取总黄酮的最佳工艺。在此基础上，采用真空薄膜浓缩，超声脱色，大孔吸附树脂Diaion HP-20吸附分离纯化含羞草总黄酮提取物。结果最佳提取工艺为用10倍量的80%乙醇为溶剂超声提取3次，10 min/次。最佳分离纯化工艺为：采用大孔吸附树脂Diaion HP-20进行分离富集，以不同浓度的乙醇进行梯度洗脱，洗脱流速为5 ml/min，收集40％～60％乙醇洗脱部位并减压浓缩得总黄酮提取物，总黄酮的含量达到76％。结论优化了含羞草中总黄酮的提取纯化方法，为含羞草资源的综合利用和产业化开发提供了 参考 。
【关键词】 含羞草 总黄酮 提取 纯化
含羞草为豆科含羞草属植物含羞草Mimosa pudica的全草［1］，又名知羞草、怕羞草、喝乎草、刺含羞草等。主要分布在我国华东、华南、西南等地的山坡丛林、湿地、路旁,具有清热利尿、化痰止咳、安神止痛、凉血止血之功效，临床多用于急性肝炎、神经衰弱、失眠、肺结核咳血、血尿、结膜炎、跌打损伤、带状疱疹等症［2］。含羞草中含有大量对人体有益的活性物质，包括黄酮类、酚类、生物活性多糖、氨基酸类、有机酸类和其它微量元素。其中的黄酮类化合物具有显著的生理活性［3～5］，如抗脂质过氧化、抗衰老、清除自由基、抗肿瘤，降低血脂、抗菌抑菌、增强免疫力等作用。本文通过正交实验考察了超声提取含羞草总黄酮的工艺，同时采用大孔吸附树脂进行吸附分离，并结合真空薄膜浓缩、超声脱色等方法对含羞草提取物进行分离与纯化，以期为 工业 化生产提供参考依据。
1 仪器与材料
1.1 仪器UV-2102PCS紫外可见分光光度计（上海龙尼柯仪器有限公司）；KQ-250B超声波提取器（昆山市超声仪器有限公司）；NJL07-3型实验专用微波炉（南京杰全微波设备有限公司，额定功率800W）；Millipore Simplicity型超纯水器（美国Millipore公司）；RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；真空薄膜浓缩装置［6］（自装）；101-1型电热恒温干燥箱；微量分析天平（EETTLER AE 240瑞士），微孔滤膜（上海医药工业研究院）；芦丁对照品（ 中国 药品生物制品鉴定所提供）。
1.2 材料与试剂
含羞草于2003-05采自海南三亚,由海南大学植物学教授黄世满鉴定为豆科含羞草属植物含羞草的全植株；所用试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 标准曲线的绘制
准确称取干燥恒重的芦丁对照品12.8 mg，加60%乙醇（体积分数，下同）溶解并定容置100 ml的量瓶中，摇匀得质量浓度为0.128 g/L的对照品溶液。分别取上述芦丁标准溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml于6只10 ml量瓶中，用60%乙醇补充至5 ml，各加入0.3 ml 5%亚硝酸钠，摇匀，放置5 min后各加入10%硝酸铝0.3 ml，摇匀。5 min后再加入1 mol/ml的氢氧化钠溶液4 ml，混匀，用60%乙醇稀释至刻度。10 min后于510 nm处测吸光度，试剂为空白参比，以芦丁质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，用最小二乘法进行线行回归,得芦丁含量与吸光度之间的回归方程:A=9.049 1C+0.006 4, r=0.999 7。
2.2 不同溶剂提取所得提取物得率及总黄酮得率的比较
2.2.1 不同溶剂提取所得提取物的得率比较
称取粉碎并过60目筛后的含羞草原料4份，每份20 g，分别选用50%的乙醇、80%的乙醇、甲醇、70%的丙酮4种不同的溶剂进行索氏提取，溶剂用量均为200 ml，提取时间为5 h。分别将提取液浓缩至稠膏状移入烘箱中烘干至恒重。称重， 计算 得率。结果见表1。表1 不同溶剂提取所得提取物及得率的比较（略）
2.2.2 不同溶剂提取所得总黄酮的得率比较
分别吸取一定量由不同溶剂提取所制得的含羞草提取液于10 ml量瓶中，添加60%乙醇溶液使体积约为5 ml，按照上述绘制芦丁标准曲线的方法，依次加入0.3 ml 5%亚硝酸钠、0.3 ml 10%硝酸铝、4 ml 1 mol/ml的氢氧化钠溶液，混匀，用60%乙醇稀释至刻度。静置20 min后用紫外可见分光光度计法测定不同溶剂提取所得提取液的吸光度，重复3次测定，并根据标准曲线换算出总黄酮的得率，计算平均含量及RSD。结果见表2。表2 不同溶剂提取所得提取物中总黄酮的得率比较（略）
由表1可以看出，由4种不同的溶剂进行索氏提取，以70%丙酮进行提取所得提取物的得率为最高；由表2可以看出，以80%乙醇为溶剂进行提取，所得提取物中总黄酮得率相对最高。虽然以70%丙酮提取得率最高且总黄酮的得率与用80%乙醇提取相当，但考虑到乙醇与丙酮相比，具有无毒安全，廉价易得的优点，故提取溶剂选用80%乙醇。
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【摘要】
目的研究提取纯化含羞草中总黄酮的最佳工艺条件。方法以芦丁为对照，含羞草总黄酮得率为考察指标，通过正交实验法优选超声提取总黄酮的最佳工艺。在此基础上，采用真空薄膜浓缩，超声脱色，大孔吸附树脂Diaion HP-20吸附分离纯化含羞草总黄酮提取物。结果最佳提取工艺为用10倍量的80%乙醇为溶剂超声提取3次，10 min/次。最佳分离纯化工艺为：采用大孔吸附树脂Diaion HP-20进行分离富集，以不同浓度的乙醇进行梯度洗脱，洗脱流速为5 ml/min，收集40％～60％乙醇洗脱部位并减压浓缩得总黄酮提取物，总黄酮的含量达到76％。结论优化了含羞草中总黄酮的提取纯化方法，为含羞草资源的综合利用和产业化开发提供了 参考 。
【关键词】 含羞草 总黄酮 提取 纯化
含羞草为豆科含羞草属植物含羞草Mimosa pudica的全草［1］，又名知羞草、怕羞草、喝乎草、刺含羞草等。主要分布在我国华东、华南、西南等地的山坡丛林、湿地、路旁,具有清热利尿、化痰止咳、安神止痛、凉血止血之功效，临床多用于急性肝炎、神经衰弱、失眠、肺结核咳血、血尿、结膜炎、跌打损伤、带状疱疹等症［2］。含羞草中含有大量对人体有益的活性物质，包括黄酮类、酚类、生物活性多糖、氨基酸类、有机酸类和其它微量元素。其中的黄酮类化合物具有显著的生理活性［3～5］，如抗脂质过氧化、抗衰老、清除自由基、抗肿瘤，降低血脂、抗菌抑菌、增强免疫力等作用。本文通过正交实验考察了超声提取含羞草总黄酮的工艺，同时采用大孔吸附树脂进行吸附分离，并结合真空薄膜浓缩、超声脱色等方法对含羞草提取物进行分离与纯化，以期为 工业 化生产提供参考依据。
1 仪器与材料
1.1 仪器UV-2102PCS紫外可见分光光度计（上海龙尼柯仪器有限公司）；KQ-250B超声波提取器（昆山市超声仪器有限公司）；NJL07-3型实验专用微波炉（南京杰全微波设备有限公司，额定功率800W）；Millipore Simplicity型超纯水器（美国Millipore公司）；RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；真空薄膜浓缩装置［6］（自装）；101-1型电热恒温干燥箱；微量分析天平（EETTLER AE 240瑞士），微孔滤膜（上海医药工业研究院）；芦丁对照品（ 中国 药品生物制品鉴定所提供）。
1.2 材料与试剂
含羞草于2003-05采自海南三亚,由海南大学植物学教授黄世满鉴定为豆科含羞草属植物含羞草的全植株；所用试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 标准曲线的绘制
准确称取干燥恒重的芦丁对照品12.8 mg，加60%乙醇（体积分数，下同）溶解并定容置100 ml的量瓶中，摇匀得质量浓度为0.128 g/L的对照品溶液。分别取上述芦丁标准溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml于6只10 ml量瓶中，用60%乙醇补充至5 ml，各加入0.3 ml 5%亚硝酸钠，摇匀，放置5 min后各加入10%硝酸铝0.3 ml，摇匀。5 min后再加入1 mol/ml的氢氧化钠溶液4 ml，混匀，用60%乙醇稀释至刻度。10 min后于510 nm处测吸光度，试剂为空白参比，以芦丁质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，用最小二乘法进行线行回归,得芦丁含量与吸光度之间的回归方程:A=9.049 1C+0.006 4, r=0.999 7。
2.2 不同溶剂提取所得提取物得率及总黄酮得率的比较
2.2.1 不同溶剂提取所得提取物的得率比较
称取粉碎并过60目筛后的含羞草原料4份，每份20 g，分别选用50%的乙醇、80%的乙醇、甲醇、70%的丙酮4种不同的溶剂进行索氏提取，溶剂用量均为200 ml，提取时间为5 h。分别将提取液浓缩至稠膏状移入烘箱中烘干至恒重。称重， 计算 得率。结果见表1。表1 不同溶剂提取所得提取物及得率的比较（略）
2.2.2 不同溶剂提取所得总黄酮的得率比较
分别吸取一定量由不同溶剂提取所制得的含羞草提取液于10 ml量瓶中，添加60%乙醇溶液使体积约为5 ml，按照上述绘制芦丁标准曲线的方法，依次加入0.3 ml 5%亚硝酸钠、0.3 ml 10%硝酸铝、4 ml 1 mol/ml的氢氧化钠溶液，混匀，用60%乙醇稀释至刻度。静置20 min后用紫外可见分光光度计法测定不同溶剂提取所得提取液的吸光度，重复3次测定，并根据标准曲线换算出总黄酮的得率，计算平均含量及RSD。结果见表2。表2 不同溶剂提取所得提取物中总黄酮的得率比较（略）
由表1可以看出，由4种不同的溶剂进行索氏提取，以70%丙酮进行提取所得提取物的得率为最高；由表2可以看出，以80%乙醇为溶剂进行提取，所得提取物中总黄酮得率相对最高。虽然以70%丙酮提取得率最高且总黄酮的得率与用80%乙醇提取相当，但考虑到乙醇与丙酮相比，具有无毒安全，廉价易得的优点，故提取溶剂选用80%乙醇。
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