作者：唐丽娟，刘玮炜 史大华 赵跃强 陶传洲
【摘要】 黄酮类化合物是一类植物次生代谢产物，因其在医药、食品及化工方面有着重要的研究价值而得到了广泛关注。各种用于研究黄酮类化合物的分离分析技术也在迅速 发展 ，薄层色谱技术仍以其快速、简便、准确度高等优点而成为鉴别黄酮类化合物的首选方法。文章综述了薄层层析技术在植物黄酮类化合物中的应用。
【关键词】 黄酮类化合物； 薄层层析； 分离分析技术
Abstract∶Flavonoids which are a kind of secondary plant metabolites have been widely investigated for thEir potential of medicine， food and chemical engineering. And separation analysis technologies applied in flavonoids are developing rapidly. Thinlayer chromatography is firstly selected in identification of flavonoids for the rapid， simple and highly accurate advantages. Application of thinlayer chromatography in flavonoids of plants was reviewed in this paper.
Key words∶ Flavonoids； Thinlayer chromatography； Separation analysis technologies
黄酮类化合物属植物多酚化合物，是植物次生代谢产物，该类化合物在医药、食品及化工方面有着重要的研究价值，已报道其有抗氧化性、抗炎抗菌、抑制血小板凝集及肥大细胞组胺释放等作用，在癌症及心脏病等疾患上也显示出 治疗 潜力，因其在花色素中的存在而可能用来代替毒性合成颜料［1］。黄酮类化合物的来源主要有天然提取和人工合成两种。其中天然提取的药物因副作用小而引起了人们更大的研究兴趣。随着植物源化合物的研究，色谱技术日益成为天然产物中生物活性成分分离纯化及分析的主要手段［2］，薄层色谱（thinlayer chromatography，TLC）即薄层层析技术是发展较早的色谱方法之一，其基本原理是利用混合物各组分在某一物质中的吸附或者分配等性能的不同，使样品溶液中各种物质进行反复的吸附或者分配等作用，从而将各种组分分开。尽管诸如高效液相色谱、气相色谱及色谱联用等 现代 色谱技术的广泛应用，薄层色谱技术以其快速、简便、准确度高等优点仍是现代实验室不可或缺的分析手段，在黄酮类化合物的研究中也被广泛应用。本文综述了薄层层析技术在植物黄酮类化合物中的应用进展。
1 TLC用于黄酮类化合物定性研究
用薄层层析进行黄酮类化合物的定性研究，目前采用的方法主要是与标准品或与 文献 对照Rf值或将测试样品图谱与标准样品图谱相比较。标准品和样品的Rf值、斑点形状颜色及有无荧光等特征都完全相同，则可作初步结论是同一化合物。但一般需结合化学反应或与紫外光谱等方法联用加以确证。卫星星 ［3］ 在硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯甲酸水(8∶3∶1)为展开剂、1% 三氯化铝乙醇溶液显色后于紫外灯下观察，苦麦供试品与对照品芦丁和槲皮素相应的位置上显相同颜色的荧光斑点，而阴性对照色谱无相同斑点显现。从层析结果可知苦麦籽壳提取物中主要含有芦丁和槲皮素两种黄酮类化合物。朱贲峰等［4］以薄层层析方法证明江西修水和福建永春的青钱柳的主要黄酮类成分基本相同，从而为对四氧嘧啶糖尿病小鼠具有显著降血糖作用的青钱柳开发研究提供了有利的证据。该方法于硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯甲酸水(8∶1∶1)为展开剂、1% 三氯化铝乙醇溶液显色时，于紫外灯(365 nm) 下检视，两种样品均与对照品色谱相应的位置上，显黄色的荧光斑点。黄绍军等［5］ 对由HPLC法纯化的晶体以硅胶GF254，展开剂甲苯氯仿丙酮（40∶25∶35）进行TLC分析，其中一种结晶与槲皮素Rf值一致，Rf=0.50；另一种结晶与山萘酚Rf值一致，Rf=0.72；同时结合熔点、液相色谱、红外光谱、核磁共振等分析方法进行结构表征，证实荔枝叶含有黄酮苷，其苷元为槲皮素和山萘酚。冯玛莉等［6］以薄层层析方法建立了沙棘黄酮的质量控制方法，即在硅胶GF254薄层板上，以甲苯醋酸乙酯甲酸(5∶2∶1)为展开剂，检出异鼠李素、槲皮素；异鼠李素、槲皮素的Rf值分别为0.60,0.49。该鉴别方法对应的样品色谱斑点清晰，无拖尾、背景无干扰且重复性好。
虽然对于一个化合物来说，比移值Rf是一个特有的常数。但在文献［5，6］中对照品均采用了由 中国 药品生物制品检定所提供的槲皮素，而在不同的色谱条件下槲皮素的Rf值分别是0.50和0.60，这就说明Rf值是受色谱条件即展开剂、吸附剂等因素影响的，因此用薄层层析进行定性分析样品和标准品应在同一薄层板、同一条件下进行，点样间隔时间不宜过长。层析条件的选择对结果是至关重要的。
2 精制
天然提取样品的纯化可以通过重结晶、柱层析等方法得到，其中薄层层析也是常用的简便方法。但操作中需注意的是薄层板面积要大，点样量和硅胶量多的前提下才适合取样和刮样。 Zhao ［7］研究组对采自新疆鹰嘴豆种子的硅胶柱层析得到的某些样品组分用硅胶薄板层析进行纯化后用以结构测试。刘玉红等 ［8］对由聚酰胺柱层析得到的黄酮活性组分进行硅胶GF254薄板(100 mm×200 mm)层析，吹干后再加点数次，层析后刮下并合并Rf值相同的色带，用乙醇溶解洗脱，得到各组分的溶液后以HPLC鉴定由薄层层析得到的样品已经达到色谱纯的要求，可以用于结构鉴定。
3 含量测定
薄层扫描法可以用于天然提取黄酮类化合物定量分析，该方法操作简便，结果可靠。王亚娟等［9］ 采用双波长薄层色谱扫描法对蒲公英总黄酮的含量进行测定。于硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯甲酸水(8∶1∶1)为展开剂展开后，测定波长λs=278 nm，参比波长λR=356 nm，测得蒲公英总黄酮含量为4.236%。
4 活性成分筛选
生物自显影技术是将薄层色谱分离和生物活性测定相结合的药物筛选方法， 是一种快速测定生物活性的手段［10］。何璐［11］ 采用甲苯氯仿丙酮（5∶5∶7）的展开剂于硅胶板分离甘草黄酮，并用生物自显影技术进行抗菌活性测定出了甘草黄酮中有抑菌活性成分，该方法操作简单、耗费低、灵敏度高。
5 薄层层析条件选择
用于黄酮类化合物薄层层析常用吸附剂是硅胶、聚酰胺。硅胶是一种极性吸附剂，一般用于弱极性的游离黄酮(黄酮苷)；聚酰胺为氢键吸附，吸附能力与酚羟基多少、位置及氢键缔合力大小有关，鉴别黄酮类化合物适用范围广。葛明菊［12］ 利用聚酰胺薄层层析分析大血藤黄酮类化合物组成，药用部位嫩茎含有Rf值为0.88的斑点而在其他部位无此斑点，分析该斑点可能为药用成分。卢端萍等［13］ 在硅胶G薄层板上以乙酸乙酯甲酸水(67∶13∶20)展开结果表明葫芦茶中含芦丁成分。黄酮苷类化合物极性强于游离黄酮，如与文献［13］相比，王怀冲［14］在硅胶G薄层板上鉴别贯叶连翘中黄酮苷类(金丝桃苷)的存在，以极性大的展开剂醋酸乙酯丁酮甲醇水(5∶3∶1∶1)展开得到了很好的分离效果。对于既有较强极性的化合物，又有较弱极性成分的混合样品中，可以采用二次或双向展开。所以鱼藤抽提液中的黄酮类化合物 ［15］在硅胶H CMC薄板上用微量圆环技术快速而有效地找到了适合的展开剂，采用双向展开得到了8个斑点，即以氯仿丙酮醋酸溶剂在竖直方向展开，再用甲苯氯仿丙酮溶剂在水平方向展开。含有多种极性成分的黄酮类化合物分离鉴别时可选用聚酰胺。刘嘉宝等 ［16］ 将聚酰胺薄层板以醋酸乙酯甲醇甲酸水（25∶1∶3∶23）为展开剂，紫外分析仪下检视。供试液在以芦丁、槲皮素、黄芩甙各标准液的相应位置出现相同的颜色斑点，它们的比移值Rf分别为0.46、0.20和0.16。因而可作定性分析的依据，说明云南松花粉中主要含有黄酮类黄芩苷、黄酮醇类芦丁及槲皮素3种成分。其他用于黄酮化合物薄层层析的吸附剂有纤维素、氰基硅胶等，纤维素用于分离极性强成分，氰基硅胶对于含不同极性成分或极性未知的黄酮化合物分离效果较佳［17］。
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【摘要】 黄酮类化合物是一类植物次生代谢产物，因其在医药、食品及化工方面有着重要的研究价值而得到了广泛关注。各种用于研究黄酮类化合物的分离分析技术也在迅速 发展 ，薄层色谱技术仍以其快速、简便、准确度高等优点而成为鉴别黄酮类化合物的首选方法。文章综述了薄层层析技术在植物黄酮类化合物中的应用。
【关键词】 黄酮类化合物； 薄层层析； 分离分析技术
Abstract∶Flavonoids which are a kind of secondary plant metabolites have been widely investigated for thEir potential of medicine， food and chemical engineering. And separation analysis technologies applied in flavonoids are developing rapidly. Thinlayer chromatography is firstly selected in identification of flavonoids for the rapid， simple and highly accurate advantages. Application of thinlayer chromatography in flavonoids of plants was reviewed in this paper.
Key words∶ Flavonoids； Thinlayer chromatography； Separation analysis technologies
黄酮类化合物属植物多酚化合物，是植物次生代谢产物，该类化合物在医药、食品及化工方面有着重要的研究价值，已报道其有抗氧化性、抗炎抗菌、抑制血小板凝集及肥大细胞组胺释放等作用，在癌症及心脏病等疾患上也显示出 治疗 潜力，因其在花色素中的存在而可能用来代替毒性合成颜料［1］。黄酮类化合物的来源主要有天然提取和人工合成两种。其中天然提取的药物因副作用小而引起了人们更大的研究兴趣。随着植物源化合物的研究，色谱技术日益成为天然产物中生物活性成分分离纯化及分析的主要手段［2］，薄层色谱（thinlayer chromatography，TLC）即薄层层析技术是发展较早的色谱方法之一，其基本原理是利用混合物各组分在某一物质中的吸附或者分配等性能的不同，使样品溶液中各种物质进行反复的吸附或者分配等作用，从而将各种组分分开。尽管诸如高效液相色谱、气相色谱及色谱联用等 现代 色谱技术的广泛应用，薄层色谱技术以其快速、简便、准确度高等优点仍是现代实验室不可或缺的分析手段，在黄酮类化合物的研究中也被广泛应用。本文综述了薄层层析技术在植物黄酮类化合物中的应用进展。
1 TLC用于黄酮类化合物定性研究
用薄层层析进行黄酮类化合物的定性研究，目前采用的方法主要是与标准品或与 文献 对照Rf值或将测试样品图谱与标准样品图谱相比较。标准品和样品的Rf值、斑点形状颜色及有无荧光等特征都完全相同，则可作初步结论是同一化合物。但一般需结合化学反应或与紫外光谱等方法联用加以确证。卫星星 ［3］ 在硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯甲酸水(8∶3∶1)为展开剂、1% 三氯化铝乙醇溶液显色后于紫外灯下观察，苦麦供试品与对照品芦丁和槲皮素相应的位置上显相同颜色的荧光斑点，而阴性对照色谱无相同斑点显现。从层析结果可知苦麦籽壳提取物中主要含有芦丁和槲皮素两种黄酮类化合物。朱贲峰等［4］以薄层层析方法证明江西修水和福建永春的青钱柳的主要黄酮类成分基本相同，从而为对四氧嘧啶糖尿病小鼠具有显著降血糖作用的青钱柳开发研究提供了有利的证据。该方法于硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯甲酸水(8∶1∶1)为展开剂、1% 三氯化铝乙醇溶液显色时，于紫外灯(365 nm) 下检视，两种样品均与对照品色谱相应的位置上，显黄色的荧光斑点。黄绍军等［5］ 对由HPLC法纯化的晶体以硅胶GF254，展开剂甲苯氯仿丙酮（40∶25∶35）进行TLC分析，其中一种结晶与槲皮素Rf值一致，Rf=0.50；另一种结晶与山萘酚Rf值一致，Rf=0.72；同时结合熔点、液相色谱、红外光谱、核磁共振等分析方法进行结构表征，证实荔枝叶含有黄酮苷，其苷元为槲皮素和山萘酚。冯玛莉等［6］以薄层层析方法建立了沙棘黄酮的质量控制方法，即在硅胶GF254薄层板上，以甲苯醋酸乙酯甲酸(5∶2∶1)为展开剂，检出异鼠李素、槲皮素；异鼠李素、槲皮素的Rf值分别为0.60,0.49。该鉴别方法对应的样品色谱斑点清晰，无拖尾、背景无干扰且重复性好。
虽然对于一个化合物来说，比移值Rf是一个特有的常数。但在文献［5，6］中对照品均采用了由 中国 药品生物制品检定所提供的槲皮素，而在不同的色谱条件下槲皮素的Rf值分别是0.50和0.60，这就说明Rf值是受色谱条件即展开剂、吸附剂等因素影响的，因此用薄层层析进行定性分析样品和标准品应在同一薄层板、同一条件下进行，点样间隔时间不宜过长。层析条件的选择对结果是至关重要的。
2 精制
天然提取样品的纯化可以通过重结晶、柱层析等方法得到，其中薄层层析也是常用的简便方法。但操作中需注意的是薄层板面积要大，点样量和硅胶量多的前提下才适合取样和刮样。 Zhao ［7］研究组对采自新疆鹰嘴豆种子的硅胶柱层析得到的某些样品组分用硅胶薄板层析进行纯化后用以结构测试。刘玉红等 ［8］对由聚酰胺柱层析得到的黄酮活性组分进行硅胶GF254薄板(100 mm×200 mm)层析，吹干后再加点数次，层析后刮下并合并Rf值相同的色带，用乙醇溶解洗脱，得到各组分的溶液后以HPLC鉴定由薄层层析得到的样品已经达到色谱纯的要求，可以用于结构鉴定。
3 含量测定
薄层扫描法可以用于天然提取黄酮类化合物定量分析，该方法操作简便，结果可靠。王亚娟等［9］ 采用双波长薄层色谱扫描法对蒲公英总黄酮的含量进行测定。于硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯甲酸水(8∶1∶1)为展开剂展开后，测定波长λs=278 nm，参比波长λR=356 nm，测得蒲公英总黄酮含量为4.236%。
4 活性成分筛选
生物自显影技术是将薄层色谱分离和生物活性测定相结合的药物筛选方法， 是一种快速测定生物活性的手段［10］。何璐［11］ 采用甲苯氯仿丙酮（5∶5∶7）的展开剂于硅胶板分离甘草黄酮，并用生物自显影技术进行抗菌活性测定出了甘草黄酮中有抑菌活性成分，该方法操作简单、耗费低、灵敏度高。
5 薄层层析条件选择
用于黄酮类化合物薄层层析常用吸附剂是硅胶、聚酰胺。硅胶是一种极性吸附剂，一般用于弱极性的游离黄酮(黄酮苷)；聚酰胺为氢键吸附，吸附能力与酚羟基多少、位置及氢键缔合力大小有关，鉴别黄酮类化合物适用范围广。葛明菊［12］ 利用聚酰胺薄层层析分析大血藤黄酮类化合物组成，药用部位嫩茎含有Rf值为0.88的斑点而在其他部位无此斑点，分析该斑点可能为药用成分。卢端萍等［13］ 在硅胶G薄层板上以乙酸乙酯甲酸水(67∶13∶20)展开结果表明葫芦茶中含芦丁成分。黄酮苷类化合物极性强于游离黄酮，如与文献［13］相比，王怀冲［14］在硅胶G薄层板上鉴别贯叶连翘中黄酮苷类(金丝桃苷)的存在，以极性大的展开剂醋酸乙酯丁酮甲醇水(5∶3∶1∶1)展开得到了很好的分离效果。对于既有较强极性的化合物，又有较弱极性成分的混合样品中，可以采用二次或双向展开。所以鱼藤抽提液中的黄酮类化合物 ［15］在硅胶H CMC薄板上用微量圆环技术快速而有效地找到了适合的展开剂，采用双向展开得到了8个斑点，即以氯仿丙酮醋酸溶剂在竖直方向展开，再用甲苯氯仿丙酮溶剂在水平方向展开。含有多种极性成分的黄酮类化合物分离鉴别时可选用聚酰胺。刘嘉宝等 ［16］ 将聚酰胺薄层板以醋酸乙酯甲醇甲酸水（25∶1∶3∶23）为展开剂，紫外分析仪下检视。供试液在以芦丁、槲皮素、黄芩甙各标准液的相应位置出现相同的颜色斑点，它们的比移值Rf分别为0.46、0.20和0.16。因而可作定性分析的依据，说明云南松花粉中主要含有黄酮类黄芩苷、黄酮醇类芦丁及槲皮素3种成分。其他用于黄酮化合物薄层层析的吸附剂有纤维素、氰基硅胶等，纤维素用于分离极性强成分，氰基硅胶对于含不同极性成分或极性未知的黄酮化合物分离效果较佳［17］。
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