【摘要】目的 比较吡柔比星（Pirarubicin，THP）和其他化疗药物对胃癌组织温热协同的作用，探讨化疗药物与温热化疗的协同作用机制。 方法 利用36个病例的手术切除胃癌组织，建立人胃癌组织体外立体培养作用模型,MTSPMS比色法检测组织培养物活性以了解化疗药物以及温热化疗的抑瘤效果。TUNEL荧光检测原位细胞凋亡,HE染色 研究 评价药物对胃癌组织在组织形态学上的改变并进行电镜观察。结果 DDP、MMC和THP对胃癌组织的杀伤均具有较强的温热协同关系（P=0.000）,THP单独处理和温热协同处理均具有较强的抑制作用，和其他3种药物抑制率比较具有显著性差异（P<0.05）。THP和温热协同处理效果和胃癌病例组织学分级有关（P=0.000），而与年龄、性别、肿瘤大小、临床分期和术前CEA水平无关（P>0.05）。THP温热协同处理凋亡指数和其他3种药物比较具有显著性差异（P<0.05）。HE染色表明，THP和温热处理后，胃癌组织大部崩解，细胞变性坏死。电镜 分析 表明经THP和温热协同处理后细胞胞膜内陷，胞浆空泡化，并出现染色质浓聚，同时核膜消失。结论 THP对胃癌组织具有良好的温热协同效应和肿瘤杀伤效果,具有进一步临床研究价值。
【关键词】吡柔比星；温热效应； 胃癌
Chemotherapy Effects of Pirarubicin in Combination with Hyperthermia on Gastric Cancer Tissues in Vitro
Abstract：Objective Comparison of the effects of pirarubicin (THP) in combination with hyperthermia on gastric cancer tissues in vitro and to discuss the underlying mechanisms.Methods In vitro threedimensional acting models were established with tissue biopsies from 36 patients with pathologically confirmed gastric cancer.Tumor cell viability was measured by MTSPMS assay.TUNEL fluorescence detection in situ apoptosis,HE staining was used to study histomorphology of drug treated gastric tissues.Electron microscope observed cells.Results Synergistic effects were observed after tumor tissues were treated with hyperthermia and three drugs including cisplatin,THP,and mitomycin (P=0.000),while THP exhibited superior cytotoxic effects to other drugs on cancer tissues.Furthermore,histomorphological studies suggested strong killing effects of THP on cancer tissues,including disrupted tissue structure,cellular degradation and necrosis,karyopyknosis and karyolysis,also with loss of cytoplasm.Antitumoral effects of THP were associated with pathological grading(P=0.000),while irrelated to patients' gender,age,tumor size，clinical staging and preoperative CEA levels(P>0.05). The apoptosis index has significant difference compared THP and the other three drugs.After treated by THP,the gastric tissues disaggregation,and electron microscope observed cell membrane invagination,endochylema vacuolization.Nuclear membrane diaappeared.Conclusion Synergistic effects of pirarubicin in combination with hyperthermia were evident; cytotoxicity of pirarubicin was thermally enhanced considerably by mild hyperthermia on gastric cancer tissue.THP may be a potential therapeutic drug for intraperitoneal chemohyperthermia.
Key words：Pirarubicin; Hyperthermia; Gastric Cancer
0 引言
消化道恶性肿瘤是临床最常见的恶性肿瘤， 目前 手术切除仍是 治疗 消化道肿瘤的首选方法，但对进展期胃肠道恶性肿瘤，根治手术后仍有较高的复发率。术中腹腔内温热灌注化疗(Itraoperative peritoneal hyperthermia chemotherapy,IPHC)直接作用于上述复发和转移部位，对预防胃肠道恶性肿瘤根治术后复发有一定作用，且副作用小，是近年来国内外研究的热点之一。然而，对于浸润腹膜下较深的肿瘤，HIPEC化疗后仍有腹膜复发。因此，研究和 应用 穿透性好的药物，提高药物穿透能力，增强热的渗透效应将是今后的研究方向。本研究拟建立胃癌组织小块三维培养技术，研究吡柔比星（Pirarubicin，THP）对胃癌组织的温热协同效应和作用机制。
1材料和方法
1.1胃癌标本2004～2005年本院行根治性胃大部切除或胃全切的胃癌手术标本36例，均经病 理学 明确诊断。其中，男22例，女14例，年龄33～85岁，平均60.7岁。患者临床分期、病理组织学分类、术前CEA水平和肿瘤直径资料，见表1。表1 胃癌病例背景资料和THP温热抑制率（略）
1.2化疗药物
顺铂(DDP)购自齐鲁制药厂，吡柔比星(THP)由深圳万乐医药有限公司提供，丝裂霉素（MMC）为日本协和发酵产品，氟尿嘧啶注射液（5Fu）为浙江海普制药公司产品。药物储存液根据说明书进行配制,储存于-20℃冰箱。
1.3试剂和耗材无酚红RPMI 1640和胎牛血清为Hyclone公司产品；MTS购自Promega公司; 硫酸酚嗪甲酯(Phenazine methosulfate,PMS)、DMSO、新霉素和两性霉素B均为Sigma公司产品；胶原蛋白海绵为北京益而康生物技术有限公司产品，规格为10×1.5×0.1，海绵使用前剪成0.5cm大小；24孔培养板为Costar产品。
1.4温热效应研究根据Hoffman[1]等方法，手术标本剥离表面的脂肪和纤维组织，用PBS清洗其表面的血污和脏物，然后将标本置于含有抗生素的浸泡液（新霉素50μg/ml，两性霉素5μg/ml）中浸泡15min。再加入1640培养液进行洗涤，用手术刀将标本尽量切割成1mm大小的小块，3块组织块加入胶原海绵上，然后转移至已预加培养基0.6ml的24孔板孔中，培养箱37℃培养过夜。第二天每孔沿孔壁缓慢加入含有药物的培养基0.4 ml，每个药物浓度3个平行孔，于42℃作用1h，然后吸出药物，培养基洗2次，加入新鲜培养液1ml继续培养3d。目前THP在温热化疗方面的应用报道甚少,本研究 参考 其静脉用药剂量(40mg/m2),浓度设定为32μg/ml。其他药物浓度参考 文献 报道[1]，其中，DDP处理浓度为50μg/ml，MMC浓度为15μg/ml，氟尿嘧啶为350μg/ml。
1.5MTSPMS比色法 MTS的配制
以DPBS配制成2mg/ml，0.22μm滤膜过滤除菌，分装。 PMS的配制：以PBS配制成100mmol/L的贮存液，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃避光保存。MTSPMS使用液：在新配制的MTS（2mg/ml）中以20∶1体积比加入PMS混和即用。MTSPMS测定方法：24孔培养板每孔加入100μl的MTSPMS使用液，继续培养4h后，振荡10min，每孔取100μl，以490nm的波长测定吸光度值（OD490），取三个平行孔均值。
抑制率(%)＝(加药孔OD-空白孔OD)/(对照孔OD-空白孔OD) ×100
1.6TUNEL荧光检测原位细胞凋亡药物处理后的组织小块置于恒冷箱冰冻切片机切片架上，待组织块冷冻变硬后切片，厚度为5～7μm。4％多聚甲醛中4℃固定30min，用0.1% TritonX100冰上穿透5min，PBS洗涤3次，共15min。加入FITC标记的TUNEl反应混合物，37℃湿盒反应90min，然后用PBS洗涤3次，共30min,80%磷酸甘油封片。取非坏死区荧光显微镜观察计数200个以上细胞，作阳性率统计（凋亡指数，AI）。
1.7组织和细胞形态学研究
药物处理后的组织小块置于10%中性甲醛中4℃固定48h，经系列乙醇脱水，石蜡包埋后切片。切片经苏木素和伊红染色，显微镜下观察温热化疗前后肿瘤组织形态学变化；用于电镜分析的标本采用2%戊二醛固定，然后依次经四氧化硪处理和梯度脱水后，包埋并切片镜检。
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