作者：邱艳，檀英霞，李立立，李素波，吕秋霜，查，章扬培
【摘要】
本 研究 采用异硫氰酸荧光素标记鼠、猕猴、猪和人的修饰与未修饰自体和异体红细胞(RBC)并给小鼠和猕猴实施输注，观察回输体内RBC 24小时存活率的变化和差异。结果发现：未修饰小鼠RBC在小鼠体内24小时存活率为74%，2.0 mmol/L mPEG-SPA修饰的小鼠RBC在小鼠体内24小时存活率为45%，两者间有显著差异；未修饰人RBC在小鼠体内24小时存活率为8%，2.0 mmol/L mPEG-SPA修饰人RBC在小鼠体内24小时存活率为5%，两者间无显著差异。修饰的猕猴RBC自体回输后24小时的存活率大于90%，而修饰的人RBC和猪RBC在给猕猴回输后2小时其存活率已降至零。结论：RBC标记 方法 及不同种实验小鼠的选择对小鼠实验结果 影响 不大，但mPEG种类和浓度对鼠RBC寿命的有一定程度影响。用鼠RBC做自体回输来评价mPEG修饰人RBC的中mPEG是否影响人红细胞的寿命是不可靠的，修饰人RBC回输给小鼠可以作为评价修饰人RBC寿命和安全性的动物模型。大哺乳动物异种RBC输注很难观察到修饰RBC的存活率和寿命长短。适合评价修饰人RBC寿命和安全性的大动物模型有待于进一步探索。
【关键词】mPEG-SPA； 红细胞；输血； 动物模型
Abstract This study was aimed to investigate the survival rate and difference of transfused modified and ummodified RBC at 24 hours. The modified and unmodified RBC from mice，monkey，pig and human were labeled by using FITC，then these blood RBCs were transfused to homogeneous and heterogeneous animals. The result showed that 24 hour survival rate of unmodified mice RBC transfused to mice was 74%，while survival rate of 2.0 mmol/L mPEG-SPA modified mice RBC transfused to mice was 45%，difference between them was significant. The 24 hour survived rate of unmodified human RBC transfused to mice was 8%，while 24 hours survival rate of 2.0 mmol/L mPEG-SPA modified human RBC transfused to mice was 5% without statistical difference. The 24 hour survived rate of homogeneous transfusion of modified monkey RBC was 90%，while survival rate of modified human and pig RBC was zero on 24 hours after transfusion to monkey. It is concluded that RBC labeling methods and mice species are unrelated to 24 hours survival rate，but mPEG variety and concentration are related to mouse RBC life-span. It is incredible to use mouse RBC homogeneous transfusion result instead of human RBC to evaluate longevity and safety of modified human RBC. But modified human RBC transfused to mice can be a model to evaluate longevity of modified human RBC. It is very difficult to get the result about modified RBC life span by RBC transfusion among great heterogeneous mammal animals. So evaluation in large mammal animal models needs to be further studied.
Key words mPEG-SPA ; red blood cell; transfusion blood; animal model
mPEG-SPA修饰的RBC输入体内的安全性及寿命是通用RBC研究的主要 内容 之一，通用RBC在未来临床的 应用 有着重要的意义。体内24小时存活率是评价RBC结构和功能是否正常的一个重要指标，为此我们采用小鼠和猕猴为实验模型，用异硫氰酸荧光素标记［1］鼠、猕猴、猪和人的修饰与未修饰的RBC，实施动物自体和异体输注，并检测回输体内RBC 24小时的荧光强度，来判断修饰与未修饰的RBC在小鼠和猕猴体内的存活情况，确定mPEG-SPA修饰对RBC寿命和对受者安全性的影响及探索建立评价和观察mPEG-SPA修饰的RBC在异种动物体内寿命和体内存活率的动物模型。
材料和方法
动物及RBC
实验动物昆明鼠由军事医学 科学 院实验动物中心提供，6-8周龄，雄性，共18只，其中12只为受血小鼠，6只为供血小鼠；猕猴由北京动物园提供，健康，雄性，共3只，其中1号猴重9.5 kg，2号猴重11 kg，3号猴重10.5 kg；AB型RhD(+)人的RBC由北京市红十字血液中心提供，猪的RBC由北京SPF中心提供。
试剂
华鑫生物工程公司的FITC; NECTAR的20 kD mPEG-SPA，北京BDST MAP血液保养液。
仪器
FACS Calibur(Becton Dickinson产品) 流式细胞仪，Beckman 5 diff血球计数仪。
小鼠实验
昆明鼠眼窝取血2 ml，加入280 μl CPDA血液保养液，2 500×g离心1分钟，用生理盐水洗涤3次，用2.0 mmol/L mPEG-SPA修饰，PBS（pH 7.2）悬浮细胞至45%；对照组小鼠RBC经洗涤后不修饰直接同样悬浮后，均与142 μg/ml FITC按1∶1混合，37℃水浴20分钟，标记对照组及修饰组小鼠，按上述步骤同样处理CPDA保存的人RBC。将每3只小鼠分为1组，共4组：分别为输未修饰小鼠的RBC的对照组（1），输2.0 mmol/L mPEG-SPA修饰的小鼠RBC的实验组（1），输未修饰的人RBC的对照组（2），输2.0 mmol/L mPEG-SPA修饰的人RBC 实验组（2）。通过尾静脉给每只小鼠输入0.5 ml悬浮RBC。输小鼠RBC的小鼠分别于注射后15、45、80分钟及2、3、4、20和24小时时剪尾取血，输人RBC的小鼠分别于注射后5、20、40、60分钟及2、3、4、18和24小时时剪尾取血，加入1％多聚甲醛固定。流式细胞仪测定百分数。把5分钟和15分钟后取血测定的荧光标记的RBC的百分数设为100％，之后将测定的百分数与之相比，绘制荧光标记RBC百分比曲线， 计算 24小时存活率，并与未修饰的RBC相比较。
猕猴实验
未修饰的人RBC与猴血浆的交叉配血
按10 mg/kg的剂量用吹管给猴子注射盐酸氯胺酮，将其麻醉，取猕猴血用冷吸收放散实验鉴定3只猕猴的类ABO血型，用热吸收放散法检测猕猴Rh血型，将未修饰的人RhD(+)ABRBC与3只猕猴血浆用抗人球方法进行交叉配血，同时做输血前血生化、血常规以及尿生化检查。
修饰的人RBC与猴血清的交叉配血
称取1.68g mPEG-SPA，加入36.7ml PBS（pH 8.0），配成 2.0 mmol/L mPEG-SPA，加入5 ml人RBC，25℃摇床摇晃60分钟修饰人RBC并加入MAP液保存。修饰后RBC与猴血清用抗人球方法进行交叉配血。
未修饰的猪RBC与猴血浆的交叉配血
取未修饰的猪血5-6 ml与3只猕猴血浆用抗人球方法进行交叉配血。
未修饰和修饰的猪RBC与猴血清的交叉配血
取猪RBC 5-6 ml 用PBS（pH 5.6）洗涤2次，按50 U/ml加入半乳糖苷酶进行酶解，酶解后用PBS（pH 8.0）洗涤1次，然后用生理盐水洗涤3次，与猴血清相配进行交叉配血。用1.0 mmol/L mPEG-SPA包裹酶解后猪RBC，再次与猴血清相配进行交叉配血，根据配血相容结果确定输注修饰的人和猪RBC的实验猴和对照猴。
输注血液的标记 按0.425 μg/ml称取FITC，并用PBS（pH 7.4）配成50 ml溶液，搅拌子搅拌过夜，充分溶解的FITC用滤器过滤，与修饰的人RBC、修饰的猪RBC以及对照猴自身RBC按11(v∶v)加入FITC溶液。37℃摇床反应30分钟，取出后用PBS（pH 74）洗涤2次，生理盐水洗涤1次，然后用生理盐水配成RBC悬液，用于输血。
收藏