前 言
胰腺是人体最重要的消化器官之一，兼有内外分泌功能。由于胰腺位置较为隐匿，位于腹膜后，其病变在临床上往往很容易被忽视。随着诊疗技术的不断进步，对胰腺病变的检出率也有所升高。常见的胰腺疾病包括胰腺癌、急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）、慢性胰腺炎（chronic pancreatitis, CP）、胰腺导管内乳头状粘液瘤等，其中，CP和胰腺癌最为重要。
CP 被定义为是一种胰腺组织进行性炎症性疾病，其病理特征主要为胰腺纤维化和腺泡萎缩，严重时可导致胰腺内外分泌功能障碍，病变多为不可逆性且具有恶变风险[1-3]。CP 病因非常复杂，可与饮酒、胆道疾病、基因突变、自身免疫紊乱等多种发病因素有关，现行比较公认的是 CPTIGAR-O 病因分类（见表一）[4]；而病因的复杂性也在一定程度上决定了其发病机制的复杂性，这也成为目前胰腺病学的研究热点所在。到现在为止，尽管对 CP 发病机制的研究较多，但是其确切的分子发病发病机制仍不明确。因此，探索 CP 相关信号转导通路，进而找到新的治疗靶点，这对于提高我国整体 CP 诊治水平、改善患者生活质量具有极其重要的现实意义。
临床上患者最常见的症状有有反复 AP 发作、单纯持续性或间歇性腹痛、糖尿病、脂肪泻、消化不良、体重减轻等。部分患者确诊时可无任何症状，仅在查体时检出胰腺钙化。根据《慢性胰腺炎诊治指南（2012，上海）》，CP 的具体诊断标准主要包括：（1）患者具有典型的临床表现（如反复发作性上腹疼痛或 AP 发作、腹泻等）；（2）经影像学检查（如胰腺薄层 CT、MRCP 等）明确有胰腺钙化、胰管结石、胰管狭窄或扩张等改变，部分患者可合并胰腺萎缩；（3）如患者接受胰腺组织活检，病理组织学评估有特征性改变（如间质纤维化、腺泡萎缩等）；（4）患者临床上确诊符合胰腺外分泌功能不全的临床表现和相关功能试验结果（如脂肪泻、消化不良等）。如患者符合（2）或（3）标准，则该患者可确诊 CP；如仅具备（1）和（4）标准，则只能初步拟诊 CP，而不能确诊，但可按照 CP 进行试验性治疗，待评估治疗效果和随访影像学检查再做出诊断。另外，该指南还提出，根据患者的主要临床表现，同时结合实验室化验和影像学检查，将 CP 主要分为四种临床分型（见表二）[5-6]，以便于临床医生对病情的评估和治疗策略的选择。在 CP 的治疗方面，目前仍无有效的治愈方法，治疗原则是缓解症状、防止复发和并发症的发生。对于确诊 CP 的患者，推荐内科保守治疗，主要采取的方法是内镜介入和药物，前者主要是胰管清理、取石，保持胰管通常；后者主要是补充胰酶、缓解腹痛。部分患者在上述治疗无效或可疑恶变时可选择接受手术治疗[7-9]。
特发性 CP（idiopathic CP, ICP）是指现有诊断技术下，无明确病因的一种类型，占 CP 比例可达 10-25%，在青少年患者的比例则更高[10]。近些年来，分子生物学和影像学诊断技术的优化有助于明确特发性 CP 的发病因素。在很多确诊为 ICP 患者中，发现其与基因突变、自身免疫紊乱、胰腺分裂等因素有关。由于这部分患者无明确的致病性环境因素，因此，也更适合作为研究 CP 遗传易感性的研究对象，成为进一步探索 CP 遗传学发病基础的突破点，进而为后续研究 CP 遗传学发病背景奠定基础。遗传性 CP 是另一种特殊类型的 CP，其具有明确的阳性遗传家族史。该疾病是常染色体不完全显性遗传，外显受环境因素影响。最常见的突变是阳离子胰蛋白酶原（cationic trypsinogen gene, PRSS1）基因。PRSS1 基因功能获得性突变可引起胰蛋白酶在胰腺内提前激活并伴有活性升高，进而引发胰腺自身被胰酶消化，从而导致 CP的发生。遗传性 CP 患者发病年龄较其他类型 CP 患者要早，出现内外分泌功能障碍的比例要高，且进展为胰腺癌的风险也高。
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第一部分青少年特发性慢性胰腺炎遗传易感性研究
ICP 是 CP 的一种重要类型，其被定义为无明确发病原因和危险因素 CP。有文献报道，约 10-25%CP 患者被诊断为 ICP。而在西方国家，青少年 ICP 患者比例可高达40-60%，在我国，这个比例则更高，可达 73.8%[11]。ICP 在临床表现和诊疗原则上无异于其他类型；但是由于其无明确的病因，因此很难找到有效的针对性治疗和预防策略。ICP 患者与其他 CP 患者一样，病情容易反复发作，病程较长，部分患者可终生发作。ICP 的发病机制目前仍不明确，尤其是青少年 ICP，研究的则更少。为此，我们考虑到青少年 ICP 患者的发病年龄比较早，其接受到外界环境因素如吸烟、酒精、代谢毒物等的影响的可能性则较小，与之相对，在他们的发病过程中，内在遗传因素的作用则相对突出，这也决定了青少年 ICP 患者更加适合作为探索 CP 遗传易感性研究的对象。
近 20 年来，对于遗传因素在 CP 发病过程中的作用逐渐被广泛认可。既往有研究相继报道了 PRSS1 基因、囊性纤维化跨膜转导调节因子基因（cystic fibrosistransmembrane conductance regulator，CFTR) (OMIM 602421)，分泌性胰蛋白酶抑制剂或 Kazal 1 型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(serine protease inhibitor Kazal type1, PSTI orSPINK1) (OMIM 167790)和糜蛋白酶 C 基因（chymotrypsin C, CTRC) (OMIM 601405)与 CP 的发生有关[12-16]。2012 年，Whitcomb DC 等通过大规模全基因组关联分析（genome-wide association study, GWAS）首次发现了与散发性酒精性 CP 相关的新的易感基因 CLDN2[17]；该基因编码的是 claudin-2 蛋白，是一种紧密连接蛋白，它在内皮细胞之间可以形成阳离子选择性通道和水通道。正常情况下，CLDN2 在胰腺导管细胞之间、胰岛细胞之间呈低表达状态，但是在胰腺腺泡细胞受到外界刺激后也可以表达。此外，还有研究报道 CP 也与拷贝数变异（copy number variations, CNVs）密切相关。然而，我国尚无 ICP 遗传学发病机制的相关报道，并且目前的研究热点也多集中在 CP 疾病本身上，而没有把青少年 ICP 作为一个单独的研究队列来进行分析。另外，考虑到与西方国家相比，我国具有不同的人口和文化特征、社会经济、气候以及生活习惯，上述差异也提示我国 CP 具有不同于西方国家的遗传学背景。另外，深入探索 CP 遗传学发病机制对于优化疾病诊治模式具有十分重要的意义[18-19]。为此，我们首次对 75 例青少年 ICP 患者进行了易感基因的检测，并对其临床特征进行关联分析。旨在通过本项研究，找到研究我国 CP 易感基因谱的契机，为今后深入探索CP 发病机制初步奠定基础。
一、资料与方法
（一）研究对象
自 1997 年 1 月至 2008 年 12 月期间，就诊于第二军医大学第一附属医院消化内科且被确诊为 CP、首次发病年龄不满 18 周岁的患者均可入选本研究。如患者有饮酒、吸烟、阳性家族史，或检出有胆道疾病、高钙血症等则被排除此项研究。通过检索电子病历系统，获取患者列表和相关临床资料，并对患者进行初步筛选；最终共纳入75 例 ICP 青少年患者。CP 诊断标准为典型的腹痛、腹泻、糖尿病等病史和至少有如下表现之一：①明确的胰腺间质纤维化、腺泡萎缩的病理学证据；②影像学证实有胰管结石或钙化、胰腺假性囊肿等特征；③ERCP 显示胰管改变，包括胰管狭窄、扩张、不规则、粗细不均、串珠状等，以及胰管结石或钙化[20]。ICP 诊断标准为已确诊 CP，但经询问病史和常规检验及腹部超声、CT 等影像学检查仍无法明确病因者。
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二、结果
（一）一般资料和临床特征
共75例青少年ICP患者纳入此项研究，其中男性40例，女性35例，男女性别比接近1：1。首次发病年龄为11.9岁（范围为3-18岁）。
81.3%（61/75）患者以AP发作为首发症状，有13例（17.3%）患者为腹痛首发，3例（4.0%）患者为体重减轻首发，1例（1.3%）患者为腹泻首发，1例（1.3%）患者为高血糖首发。
影像学检查结果显示45例（60.0%）患者有胰管结石。57例（76.0%）患者有胰管形态改变（如狭窄或/和扩张等），15例（20.0%）患者有胰腺钙化，15例（20.0%）患者有胰腺假性囊肿，4例（5.3%）患者有胰腺分裂（见表1-4）。
入院时实验室检查发现6例（8.0%）患者有CA19-9水平升高；6例（8.0%）患者有轻度血脂升高；2例（2.7%）患者有血糖升高，但未达到糖尿病的诊断标准；2例（2.7%）患者有血钙下降。
（二）PRSS1、SPINK1、CFTR、CTRC 和CLDN2基因突变检测
对 75 例患者进行了 PRSS1、SPINK1、CFTR、CTRC 和 CLDN2 基因共五个基因的检测。非同义突变包括错义突变、缺失等。PRSS1、SPINK1、CFTR、CTRC 和CLDN2 基因的非同义突变阳性率分别为 9.3%（7/75），57.3%（43/75），0.0%（0/75），0.0%（0/75）和 1.3%（1/75）（见表 1-5）。
在本项研究中，无一例患者携带 2 种以上的非同义突变。PRSS1 和 SPINK1 基因总突变率为 66.6%。此外，1 例患者携带 c.319 -326 del 新生突变，该突变位于 CFTR基因的第四外显子，为 GCTTCCTA 共 8 个碱基的缺失（见图 1-1），首次入院影像学特征见图 1-2。为明确该基因是先天遗传还是后天突变获得，我们还对其父母进行了基因检测（图 1-3），结果显示其父母并不携带该突变，故此突变为新生突变（de novomutation）。这也初步解释了临床上大多数患儿父母并非 CP 患者的现象，启发了后续对青少年 ICP 的 de novo 突变研究的开展。
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第三部分 散发性慢性胰腺炎易感基因 CPA1 突变及其与临床特征相关分析............45
一、资料与方法.............................................................46
二、结果....................................................................50
三、讨论...............................................................54
四、结论...............................................................56
第四部分 青少年特发性慢性胰腺炎相关 de novo 突变筛选及鉴定.....58
一、资料与方法.......................................................59
二、结果................................................................63
三、讨论..................................................................67
第三部分散发性慢性胰腺炎易感基因 CPA1 突变及其与临床特征相关分析
近些年来，对 CP 的研究热度逐渐上升，这主要与其发病率呈上升趋势、以及仍无有效根治措施，患者需要反复就诊等原因有关。CP 已经成为临床上最常见的胰腺疾病之一。CP 比较公认的定义是一种慢性进行性胰腺炎症性疾病，病程较长，可迁延不愈，终生发病，且症状容易反复发作，从而影响到患者的生活质量[69-70]。目前，临床上推荐的治疗方法主要包括药物、内镜介入和手术治疗，但上述方法都不能达到有效治愈 CP 的目的，因此，现阶段的对 CP 的治疗策略基本停留在“治标”的阶段。如前所述，CP 的发病机制非常复杂，多个信号传导通路和调控基因参与其发病过程，这在为今后实现 CP 的靶向治疗提供了潜在治疗靶点的同时，也为如何找到有效的治疗靶点带来了很大的难度。综上所述，研究 CP 的具体分子发病机制有助于找到新的治疗方法、开发新的药物，从而提高 CP 整体诊治水平。既往研究报道已证实 CP 具有明确的遗传学发病基础，这也是当前疾病研究的大势所趋。前期我们已经对青少年ICP 和遗传性 CP 患者分别进行了临床特征以及致病基因突变的分析，结果显示我国CP 患者可能具有与西方国家不同的遗传学发病背景[71-73]。这也高度提示有必要以我国散发性 CP 患者为研究对象，来探索具有中国特点的 CP 相关易感基因谱。与此同时，这也将弥补中国 CP 患者突变数据缺乏的不足、丰富全球 CP 遗传学研究的突变数据库。
在 2013 年，Witt H 等分别对欧洲、印度和日本散发性非酒精性 CP 患者进行了CPA1 基因突变的检测，并且提出 CPA1 基因突变与早发型 CP 有关[66]，该结论发表在《Nature Genetics》。首先，以 944 例德国非酒精性 CP 患者和 3938 例健康对照者为测序对象，筛选 CPA1 基因突变，并通过关联分析找到可能的致病突变；分别有 29例（3.1%）CP 患者和 5 例（0.1%）健康对照者携带功能缺损性突变（OR 为 24.9，P=1.5x10-16）；9.7%年轻患者（≤10 岁）携带上述突变（OR 为 84.0，P=4.1x10-24）。然后，在 600 例患者和 2432 例健康对照者组成的欧洲研究队列，230 例患者和 264 例健康对照的印度研究队列，以及 247 例患者和 341 例健康对照者的日本研究队列中进行了验证，结果显示 CPA1 缺陷型突变与 CP 发病呈正相关（P<0.05）。尽管 CP 的流行病学和发病机制具有一定的地区差异，但有研究者推测 CPA1 基因突变在 CP 发病过程中的作用可能是全球性的[74]。因此，对我国 CP 患者进行 CPA1 基因检测，可扩展基因突变数据库，丰富 CPA1 基因突变发病机制的研究。目前，尚无新的研究对CPA1 基因突变进行报道。
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第四部分青少年特发性慢性胰腺炎相关 de novo 突变筛选及鉴定
前期研究结果显示青少年 ICP 患者中已知突变的携带率并不高，因此，这高度提示可能存在其他致病突变[83-84]。同时，在临床实践中，往往观察到大多数青少年 ICP患者的父母都是正常非慢性胰腺炎健康人，这种现象引起了我们的关注。通过查阅大量文献，发现与青少年 ICP 相似，散发性精神分裂症和自闭症患者的父母也都是正常人，而且这两种疾病的患者也多为青少年发病。新近研究报道精神分裂症和自闭症与de novo 单核苷酸变异（single-nucleotide variants，SNVs）或 de novo 拷贝数突变有关，并且指出这种突变并不是偶然发生的，其突变的发生频率与多种体内外因素有关，其相关结果已发表在《Natre Genetics》、《Nature》上[85-87]。考虑到人类很多疾病具有相互重叠的遗传学发病基础，再加上青少年 ICP 也具备与上述两种疾病相似的临床病程特征，如发病年龄小、多为散发性发生等；另外，在对 75 例青少年 ICP 患者进行已知易感基因检测的前期研究中，我们已经发现有一例患儿出现CFTR基因上的de novo突变，且其父母并不携带该突变[71]。综上，我们认为可以参考精神分裂症和自闭症的研究思维和研究方法对青少年 ICP 有关的 de novo 突变进行探索研究，提出如下假设：青少年 ICP 发病可能与父母生殖细胞分裂时受到某种刺激后诱发 de novo 突变有关，这些新生突变引起一系列后续基因表达水平和/或功能异常，从而导致正常表型的父母生出 ICP 患儿。
因此，本研究在前期工作的基础上，进一步调查和收集青少年 ICP 患者及其父母的临床资料，并留取血标本，提取血 DNA。首先利用一代测序剔除 PRSS1 和 SPINK1突变阳性的家庭；对 PRSS1 和 SPINK1 突变阴性家庭成员的血 DNA 进行全基因组外显子捕获，然后应用二代测序平台进行高通量测序；最后结合测序数据，采用多学科研究方法对每个入选青少年 ICP 家庭中的三个人进行外显子定位和比对，检出 denovo 突变，然后在发现的 de novo 突变中筛选致病突变，确定和验证致病突变所在基因为致病基因，并对该基因的功能进行深入探索。另外，我们还可以进一步通过上调或沉默该致病基因的表达，来评估上述研究确定的致病基因所表达产物在 CP 发病过程中的地位。总之，发现并确定与青少年 ICP 发病有关的 de novo 突变将为找到可以安全有效治疗青少年 ICP 的新方法提供良好的研究思路，同时为全面研究 CP 遗传学发病基础奠定坚实的基础。
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参考文献（略）
胰腺是人体最重要的消化器官之一，兼有内外分泌功能。由于胰腺位置较为隐匿，位于腹膜后，其病变在临床上往往很容易被忽视。随着诊疗技术的不断进步，对胰腺病变的检出率也有所升高。常见的胰腺疾病包括胰腺癌、急性胰腺炎（acute pancreatitis,AP）、慢性胰腺炎（chronic pancreatitis, CP）、胰腺导管内乳头状粘液瘤等，其中，CP和胰腺癌最为重要。
CP 被定义为是一种胰腺组织进行性炎症性疾病，其病理特征主要为胰腺纤维化和腺泡萎缩，严重时可导致胰腺内外分泌功能障碍，病变多为不可逆性且具有恶变风险[1-3]。CP 病因非常复杂，可与饮酒、胆道疾病、基因突变、自身免疫紊乱等多种发病因素有关，现行比较公认的是 CPTIGAR-O 病因分类（见表一）[4]；而病因的复杂性也在一定程度上决定了其发病机制的复杂性，这也成为目前胰腺病学的研究热点所在。到现在为止，尽管对 CP 发病机制的研究较多，但是其确切的分子发病发病机制仍不明确。因此，探索 CP 相关信号转导通路，进而找到新的治疗靶点，这对于提高我国整体 CP 诊治水平、改善患者生活质量具有极其重要的现实意义。
临床上患者最常见的症状有有反复 AP 发作、单纯持续性或间歇性腹痛、糖尿病、脂肪泻、消化不良、体重减轻等。部分患者确诊时可无任何症状，仅在查体时检出胰腺钙化。根据《慢性胰腺炎诊治指南（2012，上海）》，CP 的具体诊断标准主要包括：（1）患者具有典型的临床表现（如反复发作性上腹疼痛或 AP 发作、腹泻等）；（2）经影像学检查（如胰腺薄层 CT、MRCP 等）明确有胰腺钙化、胰管结石、胰管狭窄或扩张等改变，部分患者可合并胰腺萎缩；（3）如患者接受胰腺组织活检，病理组织学评估有特征性改变（如间质纤维化、腺泡萎缩等）；（4）患者临床上确诊符合胰腺外分泌功能不全的临床表现和相关功能试验结果（如脂肪泻、消化不良等）。如患者符合（2）或（3）标准，则该患者可确诊 CP；如仅具备（1）和（4）标准，则只能初步拟诊 CP，而不能确诊，但可按照 CP 进行试验性治疗，待评估治疗效果和随访影像学检查再做出诊断。另外，该指南还提出，根据患者的主要临床表现，同时结合实验室化验和影像学检查，将 CP 主要分为四种临床分型（见表二）[5-6]，以便于临床医生对病情的评估和治疗策略的选择。在 CP 的治疗方面，目前仍无有效的治愈方法，治疗原则是缓解症状、防止复发和并发症的发生。对于确诊 CP 的患者，推荐内科保守治疗，主要采取的方法是内镜介入和药物，前者主要是胰管清理、取石，保持胰管通常；后者主要是补充胰酶、缓解腹痛。部分患者在上述治疗无效或可疑恶变时可选择接受手术治疗[7-9]。
特发性 CP（idiopathic CP, ICP）是指现有诊断技术下，无明确病因的一种类型，占 CP 比例可达 10-25%，在青少年患者的比例则更高[10]。近些年来，分子生物学和影像学诊断技术的优化有助于明确特发性 CP 的发病因素。在很多确诊为 ICP 患者中，发现其与基因突变、自身免疫紊乱、胰腺分裂等因素有关。由于这部分患者无明确的致病性环境因素，因此，也更适合作为研究 CP 遗传易感性的研究对象，成为进一步探索 CP 遗传学发病基础的突破点，进而为后续研究 CP 遗传学发病背景奠定基础。遗传性 CP 是另一种特殊类型的 CP，其具有明确的阳性遗传家族史。该疾病是常染色体不完全显性遗传，外显受环境因素影响。最常见的突变是阳离子胰蛋白酶原（cationic trypsinogen gene, PRSS1）基因。PRSS1 基因功能获得性突变可引起胰蛋白酶在胰腺内提前激活并伴有活性升高，进而引发胰腺自身被胰酶消化，从而导致 CP的发生。遗传性 CP 患者发病年龄较其他类型 CP 患者要早，出现内外分泌功能障碍的比例要高，且进展为胰腺癌的风险也高。
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第一部分青少年特发性慢性胰腺炎遗传易感性研究
ICP 是 CP 的一种重要类型，其被定义为无明确发病原因和危险因素 CP。有文献报道，约 10-25%CP 患者被诊断为 ICP。而在西方国家，青少年 ICP 患者比例可高达40-60%，在我国，这个比例则更高，可达 73.8%[11]。ICP 在临床表现和诊疗原则上无异于其他类型；但是由于其无明确的病因，因此很难找到有效的针对性治疗和预防策略。ICP 患者与其他 CP 患者一样，病情容易反复发作，病程较长，部分患者可终生发作。ICP 的发病机制目前仍不明确，尤其是青少年 ICP，研究的则更少。为此，我们考虑到青少年 ICP 患者的发病年龄比较早，其接受到外界环境因素如吸烟、酒精、代谢毒物等的影响的可能性则较小，与之相对，在他们的发病过程中，内在遗传因素的作用则相对突出，这也决定了青少年 ICP 患者更加适合作为探索 CP 遗传易感性研究的对象。
近 20 年来，对于遗传因素在 CP 发病过程中的作用逐渐被广泛认可。既往有研究相继报道了 PRSS1 基因、囊性纤维化跨膜转导调节因子基因（cystic fibrosistransmembrane conductance regulator，CFTR) (OMIM 602421)，分泌性胰蛋白酶抑制剂或 Kazal 1 型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(serine protease inhibitor Kazal type1, PSTI orSPINK1) (OMIM 167790)和糜蛋白酶 C 基因（chymotrypsin C, CTRC) (OMIM 601405)与 CP 的发生有关[12-16]。2012 年，Whitcomb DC 等通过大规模全基因组关联分析（genome-wide association study, GWAS）首次发现了与散发性酒精性 CP 相关的新的易感基因 CLDN2[17]；该基因编码的是 claudin-2 蛋白，是一种紧密连接蛋白，它在内皮细胞之间可以形成阳离子选择性通道和水通道。正常情况下，CLDN2 在胰腺导管细胞之间、胰岛细胞之间呈低表达状态，但是在胰腺腺泡细胞受到外界刺激后也可以表达。此外，还有研究报道 CP 也与拷贝数变异（copy number variations, CNVs）密切相关。然而，我国尚无 ICP 遗传学发病机制的相关报道，并且目前的研究热点也多集中在 CP 疾病本身上，而没有把青少年 ICP 作为一个单独的研究队列来进行分析。另外，考虑到与西方国家相比，我国具有不同的人口和文化特征、社会经济、气候以及生活习惯，上述差异也提示我国 CP 具有不同于西方国家的遗传学背景。另外，深入探索 CP 遗传学发病机制对于优化疾病诊治模式具有十分重要的意义[18-19]。为此，我们首次对 75 例青少年 ICP 患者进行了易感基因的检测，并对其临床特征进行关联分析。旨在通过本项研究，找到研究我国 CP 易感基因谱的契机，为今后深入探索CP 发病机制初步奠定基础。
一、资料与方法
（一）研究对象
自 1997 年 1 月至 2008 年 12 月期间，就诊于第二军医大学第一附属医院消化内科且被确诊为 CP、首次发病年龄不满 18 周岁的患者均可入选本研究。如患者有饮酒、吸烟、阳性家族史，或检出有胆道疾病、高钙血症等则被排除此项研究。通过检索电子病历系统，获取患者列表和相关临床资料，并对患者进行初步筛选；最终共纳入75 例 ICP 青少年患者。CP 诊断标准为典型的腹痛、腹泻、糖尿病等病史和至少有如下表现之一：①明确的胰腺间质纤维化、腺泡萎缩的病理学证据；②影像学证实有胰管结石或钙化、胰腺假性囊肿等特征；③ERCP 显示胰管改变，包括胰管狭窄、扩张、不规则、粗细不均、串珠状等，以及胰管结石或钙化[20]。ICP 诊断标准为已确诊 CP，但经询问病史和常规检验及腹部超声、CT 等影像学检查仍无法明确病因者。
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二、结果
（一）一般资料和临床特征
共75例青少年ICP患者纳入此项研究，其中男性40例，女性35例，男女性别比接近1：1。首次发病年龄为11.9岁（范围为3-18岁）。
81.3%（61/75）患者以AP发作为首发症状，有13例（17.3%）患者为腹痛首发，3例（4.0%）患者为体重减轻首发，1例（1.3%）患者为腹泻首发，1例（1.3%）患者为高血糖首发。
影像学检查结果显示45例（60.0%）患者有胰管结石。57例（76.0%）患者有胰管形态改变（如狭窄或/和扩张等），15例（20.0%）患者有胰腺钙化，15例（20.0%）患者有胰腺假性囊肿，4例（5.3%）患者有胰腺分裂（见表1-4）。
入院时实验室检查发现6例（8.0%）患者有CA19-9水平升高；6例（8.0%）患者有轻度血脂升高；2例（2.7%）患者有血糖升高，但未达到糖尿病的诊断标准；2例（2.7%）患者有血钙下降。
（二）PRSS1、SPINK1、CFTR、CTRC 和CLDN2基因突变检测
对 75 例患者进行了 PRSS1、SPINK1、CFTR、CTRC 和 CLDN2 基因共五个基因的检测。非同义突变包括错义突变、缺失等。PRSS1、SPINK1、CFTR、CTRC 和CLDN2 基因的非同义突变阳性率分别为 9.3%（7/75），57.3%（43/75），0.0%（0/75），0.0%（0/75）和 1.3%（1/75）（见表 1-5）。
在本项研究中，无一例患者携带 2 种以上的非同义突变。PRSS1 和 SPINK1 基因总突变率为 66.6%。此外，1 例患者携带 c.319 -326 del 新生突变，该突变位于 CFTR基因的第四外显子，为 GCTTCCTA 共 8 个碱基的缺失（见图 1-1），首次入院影像学特征见图 1-2。为明确该基因是先天遗传还是后天突变获得，我们还对其父母进行了基因检测（图 1-3），结果显示其父母并不携带该突变，故此突变为新生突变（de novomutation）。这也初步解释了临床上大多数患儿父母并非 CP 患者的现象，启发了后续对青少年 ICP 的 de novo 突变研究的开展。
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第三部分 散发性慢性胰腺炎易感基因 CPA1 突变及其与临床特征相关分析............45
一、资料与方法.............................................................46
二、结果....................................................................50
三、讨论...............................................................54
四、结论...............................................................56
第四部分 青少年特发性慢性胰腺炎相关 de novo 突变筛选及鉴定.....58
一、资料与方法.......................................................59
二、结果................................................................63
三、讨论..................................................................67
第三部分散发性慢性胰腺炎易感基因 CPA1 突变及其与临床特征相关分析
近些年来，对 CP 的研究热度逐渐上升，这主要与其发病率呈上升趋势、以及仍无有效根治措施，患者需要反复就诊等原因有关。CP 已经成为临床上最常见的胰腺疾病之一。CP 比较公认的定义是一种慢性进行性胰腺炎症性疾病，病程较长，可迁延不愈，终生发病，且症状容易反复发作，从而影响到患者的生活质量[69-70]。目前，临床上推荐的治疗方法主要包括药物、内镜介入和手术治疗，但上述方法都不能达到有效治愈 CP 的目的，因此，现阶段的对 CP 的治疗策略基本停留在“治标”的阶段。如前所述，CP 的发病机制非常复杂，多个信号传导通路和调控基因参与其发病过程，这在为今后实现 CP 的靶向治疗提供了潜在治疗靶点的同时，也为如何找到有效的治疗靶点带来了很大的难度。综上所述，研究 CP 的具体分子发病机制有助于找到新的治疗方法、开发新的药物，从而提高 CP 整体诊治水平。既往研究报道已证实 CP 具有明确的遗传学发病基础，这也是当前疾病研究的大势所趋。前期我们已经对青少年ICP 和遗传性 CP 患者分别进行了临床特征以及致病基因突变的分析，结果显示我国CP 患者可能具有与西方国家不同的遗传学发病背景[71-73]。这也高度提示有必要以我国散发性 CP 患者为研究对象，来探索具有中国特点的 CP 相关易感基因谱。与此同时，这也将弥补中国 CP 患者突变数据缺乏的不足、丰富全球 CP 遗传学研究的突变数据库。
在 2013 年，Witt H 等分别对欧洲、印度和日本散发性非酒精性 CP 患者进行了CPA1 基因突变的检测，并且提出 CPA1 基因突变与早发型 CP 有关[66]，该结论发表在《Nature Genetics》。首先，以 944 例德国非酒精性 CP 患者和 3938 例健康对照者为测序对象，筛选 CPA1 基因突变，并通过关联分析找到可能的致病突变；分别有 29例（3.1%）CP 患者和 5 例（0.1%）健康对照者携带功能缺损性突变（OR 为 24.9，P=1.5x10-16）；9.7%年轻患者（≤10 岁）携带上述突变（OR 为 84.0，P=4.1x10-24）。然后，在 600 例患者和 2432 例健康对照者组成的欧洲研究队列，230 例患者和 264 例健康对照的印度研究队列，以及 247 例患者和 341 例健康对照者的日本研究队列中进行了验证，结果显示 CPA1 缺陷型突变与 CP 发病呈正相关（P<0.05）。尽管 CP 的流行病学和发病机制具有一定的地区差异，但有研究者推测 CPA1 基因突变在 CP 发病过程中的作用可能是全球性的[74]。因此，对我国 CP 患者进行 CPA1 基因检测，可扩展基因突变数据库，丰富 CPA1 基因突变发病机制的研究。目前，尚无新的研究对CPA1 基因突变进行报道。
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第四部分青少年特发性慢性胰腺炎相关 de novo 突变筛选及鉴定
前期研究结果显示青少年 ICP 患者中已知突变的携带率并不高，因此，这高度提示可能存在其他致病突变[83-84]。同时，在临床实践中，往往观察到大多数青少年 ICP患者的父母都是正常非慢性胰腺炎健康人，这种现象引起了我们的关注。通过查阅大量文献，发现与青少年 ICP 相似，散发性精神分裂症和自闭症患者的父母也都是正常人，而且这两种疾病的患者也多为青少年发病。新近研究报道精神分裂症和自闭症与de novo 单核苷酸变异（single-nucleotide variants，SNVs）或 de novo 拷贝数突变有关，并且指出这种突变并不是偶然发生的，其突变的发生频率与多种体内外因素有关，其相关结果已发表在《Natre Genetics》、《Nature》上[85-87]。考虑到人类很多疾病具有相互重叠的遗传学发病基础，再加上青少年 ICP 也具备与上述两种疾病相似的临床病程特征，如发病年龄小、多为散发性发生等；另外，在对 75 例青少年 ICP 患者进行已知易感基因检测的前期研究中，我们已经发现有一例患儿出现CFTR基因上的de novo突变，且其父母并不携带该突变[71]。综上，我们认为可以参考精神分裂症和自闭症的研究思维和研究方法对青少年 ICP 有关的 de novo 突变进行探索研究，提出如下假设：青少年 ICP 发病可能与父母生殖细胞分裂时受到某种刺激后诱发 de novo 突变有关，这些新生突变引起一系列后续基因表达水平和/或功能异常，从而导致正常表型的父母生出 ICP 患儿。
因此，本研究在前期工作的基础上，进一步调查和收集青少年 ICP 患者及其父母的临床资料，并留取血标本，提取血 DNA。首先利用一代测序剔除 PRSS1 和 SPINK1突变阳性的家庭；对 PRSS1 和 SPINK1 突变阴性家庭成员的血 DNA 进行全基因组外显子捕获，然后应用二代测序平台进行高通量测序；最后结合测序数据，采用多学科研究方法对每个入选青少年 ICP 家庭中的三个人进行外显子定位和比对，检出 denovo 突变，然后在发现的 de novo 突变中筛选致病突变，确定和验证致病突变所在基因为致病基因，并对该基因的功能进行深入探索。另外，我们还可以进一步通过上调或沉默该致病基因的表达，来评估上述研究确定的致病基因所表达产物在 CP 发病过程中的地位。总之，发现并确定与青少年 ICP 发病有关的 de novo 突变将为找到可以安全有效治疗青少年 ICP 的新方法提供良好的研究思路，同时为全面研究 CP 遗传学发病基础奠定坚实的基础。
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参考文献（略）
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